微卫星DNA序列在鉴别肿瘤转移细胞中的应用

1、    微卫星DNA序列在鉴别肿瘤转移 细胞中的应用        【摘要】目的利用微卫星DNA研究人乳腺癌裸鼠模型中的遗传稳定性及其早期发现微转移的方法。方法将人乳腺癌移植于裸鼠乳腺脂肪垫，提取组织DNA，在3个微卫星位点(D14S68、D18S69、D20S199)对人乳腺癌、裸鼠移植瘤及其转移灶进行PCR分析。结果裸鼠移植瘤及其转移灶在3个位点与人乳腺癌具有相同的微卫星DNA。结论裸鼠移植瘤及其转移灶来源于人乳腺癌。人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移，

2、体外培养过程中具有遗传稳定性。本法是一种简单、敏感、特异性强的鉴别肿瘤转移细胞的方法。关键词乳腺肿瘤微卫星DNA微转移异种移植THE USE OF MICROSATELLITE DNA MARKERS FOR DISTINGUISHING METASTATIC TUMOR CELLSLi Zhihong*, Huang Xinfu, Ke Yang, Wang Yongxin, Yang Langui, Feng Liya.*Department of Surgery and Laboratory of Cytogenetics, Beijing, Institute for Cancer R

3、esearch, Beijing, 100034 P.R.China【Abstract】ObjectiveTo study the genetic stability and to establish a method for detection of micrometastasis using microsatellite DNA in human breast cancer xenograft in nude mice.MethodsFresh tissue of human breast cancer was xenotransplanted in nude mice orthotopi

4、cally. Genomic DNA extracted from tissues of human breast cancer, xenotransplanted tumors and metastatic foci in nude mice were PCR amplified at three microsatellite loci(D14S68,D18S69,D20S199) and were analysed by electrophoresis and silver stain on PAGE.ResultsMicrosatellite DNA in genome of the x

5、enotransplanted tumors and metastatic foci in nude mice were identical with that of the human breast cancer.ConclusionThis study has demonstrated in nude mice the xenotransplanted tumors and metastatic foci that originated from human breast cancer. The genetic stability in human breast cancer is evi

6、dent in the processes of xenotransplantation, serial passages in nude mice, metastasis and in vitro culture. This method is sensitive and specific for the discrimination of metastatic tumor cells.【Key words】Breast neoplasmsMicrosatellite DNAMicrometastasisXenograft很多人肿瘤裸鼠模型转移率甚低1，这与这些肿瘤在人体中容易转移的情况不符

7、，其原因除了模型内在的因素外，可能还与转移检测方法上的不灵敏有关。传统的组织学连续切片费时费力，漏检率高。新近有人利用原位杂交2和LacZ基因转导等技术3检测微转移，但这些方法相对复杂，技术条件要求高，并且只能检测裸鼠中的微转移，目前尚缺乏简单、灵敏、直接在人体中发现微转移的方法。长期以来，人们主要利用染色体核型和同工酶分析证明人肿瘤与裸鼠移植瘤的同源性，但这两种方法对标本要求高，需体外培养或需较大的肿瘤体积，而微卫星DNA的发现却为解决此问题提供了捷径。我们选择3个微卫星位点，采用PCR等方法为解决上述问题做了初步尝试，并为直接在人体中发现微转移提供了线索。1材料和方法1.1实验动物BALB

8、/C，nu/nu裸小鼠，由军事医学科学院提供，鼠龄46周，体重1320克，雌性，无菌条件下饲养。1.2标本1.2.1人乳腺癌标本采自本院外科，患者女性，56岁，乳腺典型髓样癌，有腋淋巴结转移，ER(-)，PR(-)。取直径为6mm的新鲜肿瘤组织，剪碎种植入裸鼠乳腺脂肪垫，观察肿瘤生长情况。1.2.2裸鼠移植瘤及其转移灶标本待裸鼠濒死时处死，取出移植瘤，切取直径为6mm的组织剪碎种植入下一代裸鼠乳腺脂肪垫，如此连续传8代。取第3代 表1微卫星引物的详细资料Tab 1Data of the microsatellite primersChromosome(染色体)Locus(位点)Heterozy

9、osity(%)杂合度(%)Chromosomemap(染色体定位)Type(重复类型)Allele size(bp)产物大小(bp)14D14S68DI*148-17218D18S69DI192-21020D20S19920DI108-126DI：Dinucleotide(二核苷酸)裸鼠移植瘤体外培养，连续传代，取第36代体外培养细胞1×106注射入裸鼠乳腺脂肪垫。取被处死的裸鼠移植瘤、肺、肿大淋巴结，部分组织常规病理切片，部分置入液氮中留待提取DNA。分别取人乳腺癌石蜡包埋组织、第1代、第8代裸鼠移植瘤、第36代体外培养细胞移植裸鼠所获肿瘤、常规病理发现转移的肺和肿大淋巴结、正常

10、裸鼠肺组织提取DNA。1.3主要试剂3个位点的微卫星引物购自美国Research Genetics Inc.(表1)。1.4PCR扩增微卫星序列10l反应体系中含有样本DNA约0.1g、引物各5pmol、TaqDNA聚合酶0.3l。反应条件为94预变性10分钟，而后94 30秒、56 30秒、72 30秒，共36个循环，最后56延伸5分钟。1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳取5lPCR产物与10l加样缓冲液(0.2mmol/L EDTA、0.05%溴酚蓝、0.05%二甲苯青FF)混合，电泳在DNA测序仪上进行，每孔加样15l，非变性上样。凝胶条件为8%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳液为1×TBE，室温

11、下，恒功率6W，待二甲苯青接近下缘时，关闭电源，取下凝胶。1.6银染检测取下凝胶依次置于10%乙醇10分钟，1%硝酸35分钟，0.012mol/L硝酸银(每100ml硝酸银加甲醛100l)30分钟，预冷的0.28mol/L碳酸钠(每100ml碳酸钠加甲醛50l)510分钟，10%冰乙醇固定。2结果我们分析了人乳腺癌、裸鼠移植瘤及其转移灶、体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤、裸鼠正常组织中基因组DNA的微卫星序列。结果显示：基因组DNA经3个位点的微卫星引物扩增，第26号标本分别获得与人乳腺癌相同片段的产物，而裸鼠正常组织在3个位点或未见扩增片段，或扩增出完全不同的带型，说明裸鼠移植瘤及其转移灶、

12、体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤均来源于人乳腺癌，裸鼠肺和淋巴结确有人乳腺癌转移灶，并且人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性(附)。 附7个标本DNA在微卫星位点D14S68(A)、D18S69(B)、D20S199(C)的扩增和电泳结果1：人乳腺癌；2：第1代裸鼠移植瘤；3：第8代裸鼠移植瘤；4：第36代体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤；5：病理发现转移的裸鼠肺；6：病理发现转移的裸鼠淋巴结；7：正常裸鼠肺；M：MarkerFigAnalysis of MS DNA marker of seven specimens DNA at loci D14S68(

13、A),D18S69(B),D20S199(C).PCR products at specific locus are subjected to 8% PAGE for separation and silver-staining for visualizationLane 1:Human breast cancer;Lane 2:The xenotransplant of the first generation in the nude mouse; Lane 3: The xenotransplant of the eighth generation in the nude mouse;La

14、ne 4:The xenotransplant of tumor cells cultured in vitro for thrity-sixth generation;Lane 5:The metastatic lung of the nude mouse;Lane 6:The metastatic lymph node of the nude mouse;Lane 7:The lung of the normal nude mouse;M:Marker3讨论微卫星DNA是1981年Miesfeld等4首次发现的，这是一种数目高度可变的串联重复短序列，以26个核苷酸为重复单位，长度为1060

15、bp，常见的为双核苷酸CA重复。在基因组中分布广泛，平均50kb就有一个重复顺序，重复单位结构相同，突变率低(0.04%)，在人群中高度多态，其多态信息容量超过70%。且其重复单位小，长度较短，利于应用PCR技术进行检测。这些优点使其成为目前最佳的遗传标记58。现在，一个乳腺癌新药药效结论在得出之前需长达510年的临床试验。并且，宿主因素、肿瘤细胞与间质的关系等在肿瘤形成和转移过程中的重要作用已越来越受到了人们的重视，而裸鼠模型因其既能进行相对迅速的药效评估，又提供了与人体类似的体内环境而倍受人们的青睐。但由裸鼠模型得出的实验结果是否适用于人类呢?这就需要证明人肿瘤与裸鼠移植瘤的同源性。以微卫

16、星序列作为遗传标记为此问题的解决提供了良好的手段。根据Hardy-Weinberg理论，以现在的世界人口总数，不可能有两个个体在3个位点上的微卫星序列均相同。因此理论上，随机选取3个微卫星位点即可充分说明人乳腺癌与裸鼠移植瘤的同源性。但我所细胞遗传室的前期工作表明，在微卫星位点D14S68、D18S69、D20S199的PCR条件易于控制，结果稳定，带型清晰。所以我们选择了这三个位点。本实验中第1代、第8代裸鼠移植瘤、体外培养传代细胞移植裸鼠所获肿瘤、裸鼠转移灶在3个位点与人乳腺癌均具有完全相同的扩增产物，而裸鼠正常组织的扩增产物明显不同，因此完全可以证明裸鼠移植瘤及转移灶来源于人乳腺癌。亦可

17、以说明人乳腺癌在异种移植、裸鼠体内连续传代及转移、体外培养过程中具有遗传稳定性，此点与文献报道的微卫星DNA突变率极低是相符的。人肿瘤裸鼠转移模型中微转移灶的早期发现一直是此研究中的难点。近来有人利用生物素标记的Alu探针，采用原位杂交、斑点分析技术，检测人基因组中所特有的Alu序列从而发现转移灶2，但此法在操作过程中应注意严禁人体细胞的污染，否则将产生假阳性反应。另有人将Ecoli LacZ基因转导入肿瘤细胞，此基因的产物-D-半乳糖苷酶可与X胶反应产生蓝黑色产物从而检测转移3，但此技术相对复杂，技术条件要求高，目前较难推广应用。我们通过检测转移灶的微卫星DNA，在一个裸鼠淋巴结和长径约4m

18、m的裸鼠肺组织中发现了微转移灶，且从提取组织DNA至银染完毕，整个过程仅需23天，说明本法是一简便、敏感、准确的发现和鉴定裸鼠移植瘤微转移的方法。更为重要的是，Alu探针原位杂交和LacZ基因转导两种方法只是对裸鼠模型中的微转移进行检测，不能直接发现人体(如血液)中的微转移。可以预见，此问题的解决必将对转移诊治的研究产生深远的影响。本实验结果为直接在人体中发现微转移提供了线索。自从1993年Altonen等9在遗传性非息肉样结直肠癌中发现微卫星不稳定性(microsatellite instability,MSI)以来，人们又在很多肿瘤中发现了MSI。已有实验证实，MSI仅在肿瘤细胞发现，从未

19、在与肿瘤相邻的正常组织中发现。MSI与肿瘤的发展有关，在原发瘤与其转移瘤中，MSI均匀分布于整个肿瘤。这提示MSI是在肿瘤细胞克隆之前或刚克隆之时发生的现象，MSI在肿瘤细胞转移过程中不会发生变化10，也就是说原发肿瘤与其转移灶具有相同的MSI。这样，我们就可以选择具有MSI的肿瘤患者，应用我们所采用的方法检测其血液中是否存在转移细胞，从而在很早期就在人体血液中发现微转移。如果实验证实此法可行，它将在临床治疗方案的选择、迅速精确的药效评估、患者预后的预测等方面具有重要价值。本课题由北京市自然科学基金(7972011)资助作者单位：100034北京市肿瘤研究所北京医科大学临床肿瘤学院外科(李志洪

20、、黄信孚、杨兰桂)，细胞遗传室(柯扬、王永信、冯莉雅)参考文献1Manzotti C, Andisio RA, Pratesi G. Importance of orthotopic implantation for human tumors as model systems:Reference to metastasis and invasion. Clin Exp Metastasis,1993,11(1)5-14.2Mckenzie BA, Barrieux A, Varki NM. A novel detection system for submicroscopic human me

21、tastansis in athymic mice. Cancer Commun,1991,3(1)15-19.3Lin WC, Pretlow TP, Pretlow TG, et al. Bacterial LacZ gene as a highly sensitive marker to detect microsmetastasis formation during tumor progression. Cancer Res, 1990,50(9)2808-2817.4Miesfeld R, Krystal M, Arnheim N. A member for a new repeated sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found between the human and globin genes. Neucleic Acid Res, 1981,9(22)5931-5947. 5Jame LW, Paula E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction.