茶叶中有机磷农药残留检测方法研究

1、四川理工学院毕业论文茶叶中有机磷农药残留检测方法研究学 生：阳 豪学 号：10031030120专 业：应 用 化 学班 级：2010级1班指导老师：谭文渊、付大友四川理工学院材料与化学工程学院二一四 年 六 月I四川理工学院本科毕业论文 摘要茶叶中有机磷农药残留检测方法研究摘 要本文建立了GC-MS法测定茶叶中有机磷常见的3种有机磷农药残留，其色谱条件：色谱柱（14%氰丙苯基，86%二聚硅氧烷），流速1.200mL/min，扫描范围：25300全扫描。样品制备：称取2.0g茶叶，用乙腈浸泡，超声振荡15min，用2.0g炭粉吸附色素，过滤，再用氮气吹干浓缩，最后用正己烷定容至2mL。采用Tr

2、ace1310-TSQ8000气质联用仪，TG-1701MS色谱柱，本方法对3种有机磷农药的回收率范围64.23%71.39%，检出限为0.0050.02mg / kg。相对偏差（RSD）小于6.2%。结论：本方法操作简便，结果较为准确，精密度良好，可用于茶叶中有机磷农残的检测。关键词：GC-MS；茶叶；农药残留；有机磷I四川理工学院本科毕业论文 AbstractStuding on the detection methods of the organophosphorus pesticide residues in teaAbstractThe determination detection

3、 method of three common sorts of organophosphorus pesticide residues in tea was established by GC-MS in this paper. The column, made up of 14 propyl phenyl cyanide and 86 two polysiloxane, was used, and the flow rate was at 1.200mL/min, with the scan tempeture between 25300. Sample Preparation: Weig

4、h 2.0g of tea, soaked with acetonitrile, ultrasonic oscillation 15min, 2.0g charcoal adsorption with pigments, filtered and concentrated to dry with nitrogen and finally with hexane to volume 2mL.The pesticides were analyzed by GC-MS(Trace1310TSQ8000) with TG-1701MS capillary column. The results sho

5、wed that the recoveries of these three common pesticides were between 64.23%71.39%, and the LOD between 0.0050.02mg / kg. The relative standard deviation(RSD) was less than 6.2%. Conclusion: The method is accurate and reliable, and is readily applicable to detection of organophosphorus pesticide res

6、idues in tea.Key words: GC-MS;Tea; Pesticide residue; Organphosphorus 四川理工学院本科毕业论文 目录目录摘 要IAbstractI目录II第一章 绪论- 1 -1.1 研究背景- 1 -1.2 国内外研究现状- 2 -1.2.1 有机磷农药残留前期处理方法- 2 -1.2.2 有机磷农残检测方法- 5 -1.3 农药残留分析的发展趋势- 8 -1.4 研究目的及意义- 8 -第二章 实验部分- 10 -2.1 实验原理- 10 -2.2 实验仪器- 10 -2.3 实验药品- 11 -2.3.1 实验药品- 11 -2.4

7、实验条件- 12 -2.4.1 色谱条件- 12 -2.5 实验方法- 12 -2.5.1 样品前处理方法- 12 -2.5.2标准曲线的测定- 12 -2.5.3 样品的测定- 12 -2.5.4 回收率与精密度实验- 12 -2.5.6 检出限实验- 13 -第三章 结果与讨论- 14 -3.1 样品前处理方法的选择和优化- 14 -3.1.1 茶叶在活性炭粉加入量的讨论- 14 -3.1.2 茶叶提取液的振荡时间的讨论- 14 -3.1.3 离心时间、转速的讨论- 15 -3.2 待测有机磷农药的选择- 16 -3.3 有机磷农药定性分析- 16 -3.4 样品有机磷农药定量分析- 16

8、 -3.4.1 标准曲线的绘制- 16 -3.4.2 样品的测定- 18 -3.5 加标样品的测定- 18 -3.6 方法回收率- 19 -3.7 精密度- 19 -第四章 结论与展望- 20 -4.1 结论- 20 -4.2 展望- 20 -致谢- 21 -参考文献- 22 -附录：- 24 -III四川理工学院本科毕业论文 绪论第一章 绪论1.1 研究背景食品安全问题是关系到人类健康和国计民生的重大问题，作为食品的茶叶不仅是我国人民喜爱的一种主要消费饮料，而且也是我国一项传统的大宗出口农产品12。目前世界上有160多个国家有饮茶的习惯，被誉为“东方文明象征”的茶在西方正在发出绚丽的光彩。随

9、着茶叶出口数量的不断增加，内需的不断扩大，对茶叶质量安全也提出了更高的要求34。近几年来，随着无公害食品行动计划的实施，各级政府对食品安全的高度重视，正加大力度禁止在茶叶中使用高毒、高残留农药，扶持龙头企业加速茶叶加工厂的改造，来提高我国茶叶质量安全水平。茶叶是直接泡饮的食品，其卫生质量与人类健康息息相关。近年来，为限制滥用农药，维护人民利益，国内外市场都加强了对茶叶卫生质量的监测，对茶叶中的各类农药残留也提出了越来越苛刻限量要求。茶叶作为我国传统的经济作物和出口商品，近几年随着出口贸易量的不断增长，贸易技术问题也不断涌现，农药残留问题尤为突出。有机磷农药是茶叶种植户经常使用的一种杀虫剂，由于

10、价格便宜，杀虫效果好，被广泛使用。随着人们生活质量的提高和我国对外贸易的扩大，茶叶的安全卫生越来越受到人们的重视，已经成为国际贸易中的技术焦点。但是我国茶叶农药残留超标问题严重，欧盟已将我国列入农药残留量或潜在水平较高的国家之一，并加大了从我国进口茶叶的监控56。通过调查发现，由于暖冬时常发生，虫害加大，一些农民更愿意使用高毒高残留的农药，这样一方面可以降低农药的购买成本，另一方面也降低了施药的频度，节约了劳动力。在我国加入世界贸易组织后，除了采取必要的农业措施，降低茶树、土壤和灌溉水中的农药残留量，还需发展茶叶中农药残留的快速检测方法，特别是一些禁止使用在茶叶中的高毒高残留的农药，来适应世界

11、贸易市场和我国人民的需要。另外许多国家制定了茶叶中农药残留的限量标准，欧盟所颁布的农药残留标准涉及茶叶指标的目前已达189种，一些农药指标的设置，已降为原有指标的1%10% ，更有超过85%的指标采用仪器检测低限作为标准规定，即要求分析仪器不得检出，日本在2006年6月开始实施的新食品卫生法，不仅将茶叶设限农药数量增加到214种，还规定设限外的500多种农药残留以“一律标准”严格要求，即统一以0. 01mg/kg为限量，同时将检测茶汤的方法由原先采用的茶汤检测法，修改为更严格的试剂直接提取干茶法。农药残留量问题一直受到国内外的普遍关注，并成为制约我国茶叶及其制品出口的主要问题。如何通过检测，更

12、快、更有效地控制农药残留的问题是打破贸易壁垒的关键，为提高农产品中有机磷残留检验结果的准确性和保障人民健康及各国的正常贸易，如何检测出茶叶中有机磷农药就显得尤为重要。1.2 国内外研究现状 1.2.1 有机磷农药残留前期处理方法农药残留分析方法通常包括样品前处理和检测两部分，样品的前处理技术是农药残留分析的基础与关键，具有浓缩被测的痕量组分、提高方法灵敏度及去除干扰物质的作用。近年来，新的前处理技术不断推出和应用，既节省了分析时间，提高了工作效率，也使整个分析过程更趋绿色环保。这些新的前处理技术包括超临界流体萃取技术、固相萃取技术、固相微萃取技术、搅拌棒吸附萃取技、基质固相分散技术、液相微萃取

13、技术以及分散液相微萃取技术等。1.2.1.1 超临界萃取技术（SFE）超临界萃取技术(supercritical fluid extraction， SFE)是用超临界液体作为萃取剂，根据样品中组分在不同压力和温度条件下溶解能力变化的性质，通过改变萃取剂流体的压力，从而将不同组分萃取出来。其最大优点是使用CO2等流体代替有机溶剂，对人体无害、绿色环保，且有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散，提高了样品回收率。因而较适合于萃取热不稳定物质和有毒化合物7。D.H.Kim等8已将SFE用于萃取面粉里的有机磷残留，避免了样品浓缩和分析过程的干扰，提高了萃取速度， 60min有7g的样品萃取量，且联用GC

14、-NPD分析后，检测限低至10 ng/g。SFE是多种农药残留分析中比较有前景的一个方法，十几年来有了长足的发展，但该方法对羟基基团的萃取稍显困难且常规分析应用还较少。1.2.1.2 固相萃取技术（SPE）固相萃取技术(solid phase extraction， SPE)基于液-固分配原理，利用固体吸附剂将液体中的农残化合物吸附，然后用洗脱液淋洗，富集目标化合物进行分析。该技术高效、可靠、消耗试剂少，且技术成熟，应用广泛，是目前国内外有机磷残留分析样品前处理中的主流技术9，使许多复杂的样品处理难题迎刃而解。但该方法使用的装置较贵，操作繁琐，不同批次生产的SPE装置重现性差且样品用量较大。1

15、.2.1.3 固相微萃取技术（SPME）固相微萃取技术(solid-phase micro extraction， SPME)，是在1990年首次提出的，1994年即被应用在农药检测中。SPME是在SPE的基础上发展起来的，集采样、萃取、浓缩、进样于一体的综合技术。其原理是将涂有聚合物(固定相)的熔融石英纤维伸进样品基质或悬于样品上方的顶空体中，目标化合物被吸附在固定相上，经解析后直接测定10。它与SPE相比，不使用有机溶剂为萃取剂，操作简便，只需几分钟即可完成目标物萃取，与GC联用可测定血液等微量样品中的有机磷农残，检测限低至ng/g级。1.2.1.4 搅拌棒吸附萃取技术（SBSE）搅拌棒吸

16、附萃取(Stir bar sportive extraction， SBSE)是由荷兰教授E.Baltussen等人于1999年提出的比较符合环保要求的萃取技术。其原理与SPME相似，是将涂有聚二甲基硅氧烷(PDMS)固定相的磁性搅拌棒直接伸进样品中搅拌并萃取30240 min后，去除搅拌棒上的水分，经专用的热解析装置解析，联用色谱或质谱分析。该技术简单、高效，无溶剂，不会造成二次污染，与纤维针式固相微萃取(F-iber-SPME)相比， SBSE的萃取固定相体积和灵敏度提高了50250倍，所以更适合痕量有机物的萃取富集。但由于SBSE使用了更多的固定相，因而也需更长的时间吸附溶质。近年来，该

17、技术在环境、生物及农残等样品分析中都取得了良好的效果。在与SPME的对比中， SBSE被推荐为更适合萃取蜂蜜等高粘性样品中有机磷的方法。C.Blasco等11 萃取分析了15种商业蜂蜜中包括地虫磷在内的6种有机磷残留，结果显示SBSE的精密度和灵敏度分别是SPME的510倍及1050倍。最近，已有文献研究新的固定相应用于SBSE，但目前商品化的只有Gestel GmbH公司的PDMS固定相一种。因此，开发更多可商品化的固定相涂料应用于该技术将是未来研究的方向之一。1.2.1.5 基质固相分散技术（MSPD）基质固相分散(matrix solid-phase dispersion， MSPD)是

18、一种特殊的固相萃取技术。自1989年由Barker教授12首次提出以来便成为萃取果蔬、牛奶和水果中有机磷、有机氯和拟除虫菊酯等农残的有效手段。其原理是将试样直接与适量吸附剂(如C18)研磨、混匀制成半固态物质装柱， 然后用有机溶剂洗提、分离待测物进行测定。该方法成功避免了液-液分配中出现的乳化现象以及样品损失， 节约溶剂，污染少，且与其它一些分离、检测方法有良好的兼容性。在检测高脂肪和高粘性鸡蛋样品里的有机磷等农残时，采用C18作为吸附剂研磨，乙酸乙酯和乙腈为洗脱液的MSPD前处理方法，通过GC-QqQ-MS/MS准确定量和定性，结果表明该方法检测种类高达57种，样品分离仅需17.70 min

19、，同时避免了传统萃取时待测物的损失。由于MSPD技术可对固体、半固体或粘性液体样品中目标物质进行萃取，且易自动化，因此可以预见该技术在现代农残检测的应用将会越来越广泛。1.2.1.6 液相微萃取技术（LPME）液相微萃取(Liquid-phase micro extraction ，LPME)也称溶剂微萃取(solvent micro extraction ，SME)，是1996，Jeannot等13在改进液液萃取(LLE)的基础上，最先提出的一种前处理技术。一般来说，液相微萃取有两种模式，一种是直接液相微萃取(DI-LPME)，另一种是顶空液相微萃取(HS-LPME)。直接微萃取是将挂在微量

20、进样器上的有机溶剂滴浸入水样中，待测物通过扩散进入有机溶剂，过了设定时间后将液滴抽回注射器，直接注入GC分析，不需任何预处理和提纯。顶空液相微萃取与直接微萃取的操作基本类似，所不同的是进样器上的有机溶剂液滴是悬于密封瓶中水样的上方。LPME具有简单、低廉和使用溶剂少，易与GC、HPLC或LC-MS直接联用等优点。Khalili-Zanjani等应用LPME-GC-FPD萃取、检测了水样中的9种有机磷杀虫剂，在最佳条件下，方法的的检出限为0. 010. 04mg/L，基体加标回收率为96%104%。此外， 利用室温离子液体代替有机溶剂，结合LPME技术分析环境中的有机磷等污染物，取得了低的检测限

21、和良好回收率，拓展了LPME的应用范围。1.2.1.7 分散液相微萃取技术（DLLME）分散液相微萃取(dispersive liquid- liquid micro extraction， DLLME)由M. Rezaee等14于2006年首次提出，其原理与LPME相同，是对LPME的改进和发展。目的是为了解决待测物损失、缩短样品处理时间等问题。研究人员把少量的有机分散剂加入到有机萃取剂中一起混合快速地注入水样形成乳浊液，水样中的待测物被分散的有机萃取剂富集，经过几分钟的离心分层，用微量进样器吸取萃取溶剂直接注入GC或HPLC进行分析。实验证明，分散液相微萃取需要的萃取溶剂非常少，与SPME

22、等相比，萃取时间更短，只需几分钟却对萃取结果毫无影响，同时温度和盐浓度也对萃取结果几乎不产生影响。分散剂的选择对实验结果有一定的影响，但并不显著，唯一具有影响的是萃取剂的选择。因此，DLLME只适用于亲脂性高或中等的分析物(K>500)，对于高度亲水的中性分析物，是不适用的;而对于具有酸碱性的分析物，可通过控制样品溶液的pH值使分析物以非离子化状态存在，从而提高分配系数。目前，该技术应用于水样中有机化合物以及农残的萃取分析较为普遍。选取氯苯为萃取剂，丙酮为分散剂，结果只需5mL的样品量及少于3 min的提取时间便可萃取水中13种有机磷残留，检测限更低至3 pg/mL。E. C. Zhao

23、等将DLLME运用范围扩展到食品行业， 用于萃取西瓜和黄瓜的有机磷残留， 结果表明回收率为67% 111%，相对标准偏差为2% 9%。该技术已成为前处理技术领域新的研究热点，引起农药残留分析界的高度关注。1.2.1.8 超声波辅助提取法超声波提取法就是利用超声波来加速物质的化学反应、或启动新的反应途径、或改善其溶解能力等物理化学性能，以提高化学反应产率、或获得新的化学反应物质、或提高物质的分离提取效率。超声波提取法在提取过程中产生的冲击波能直接反复高频冲击食品，破坏食品和农药的表面吸附，加速农药在提取液中的溶解和扩散，这大大缩短了分析测试的时间，加快了分析的速度，提高了农药残留的提取率。超声波

24、辅助提取法已在食品的农残分析中得到广泛应用，杜晓刚等将超声波提取-吸附分离的预处理技术用于气相色谱法检测茶叶中的农药残留，经试验表明该方法回收率高，灵敏度高。夏潇潇等15采用超声波萃取LC-MS-MS 分析技术对叶菜中28种农药残留建立了快速检测方法，回收率为83.6%98.7%。魏俊岭等对比超声波提取与其他传统提取法在气相色谱法测定蔬菜中有机氯农药残留，结果表明，超声波提取法回收率达到82.8%-110.2%，回收率高于震荡提取和索式提取。1.2.1.9 其他处理方法除了上述常用方法外还有凝胶渗透色谱技术（GPC）、微波辅助萃取技术（MAE）、加速溶液萃取（ASE）、旋转蒸发、索氏提取等。1

25、.2.2 有机磷农残检测方法有机磷农药的测定方法有酶抑制法、生物传感器法、分光光度法、比色分析法、电化学法和色谱法等。由于有机磷在茶叶中含量很低，属于痕量级。所以对方法的灵敏度等的要求比较高。1.2.2.1 酶抑制法酶抑制法主要是根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死的毒理学原理来检测农药残留16。利用农药对胆碱酯酶的抑制作用，加入特定显色剂，通过颜色深浅的变化确定是否有农药残留及其相对量。按胆碱酯酶分解底物和采用仪器不同，常分为酶抑制率测定法和速测卡法两种。酶抑制率测定法，利用农药对胆碱酯酶的

26、抑制作用与农药残留量成正相关，胆碱酯酶催化水解物与显色剂反应，产生黄色物质，用速测仪在410nm 等特定波长处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率并依此判别样品中是否有农药残留。目前市场上速测仪产品众多，有2、4、8、10、24、36、96通道等多种，大多是由分光光度计在结果计算功能上进行改进的专用农残速测仪。使用的胆碱酯酶以乙酰胆碱酯酶（AChE）和乙酰胆碱酯酶（BChE）为主，用抑制率判定超标与否。该方法用简单方便，可直接显示检测结果，也可通过数据管理软件上传检测数据，是目前省市和县区质检单位日常检测的主要速测仪器。速测卡法（纸片法），将胆碱酯酶和淀粉乙酸酯固化在卡片上，利用胆碱酯酶催化

27、水解淀粉乙酸酯（红色）为乙酸和淀粉（蓝色），有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的催化有抑制作用，使催化、水解、变色过程发生改变，从而判断样品中是否有农药残留存在，使用的胆碱酯酶以AChE 为主17。该方法常使用部分专用速测仪进行酶反应等操作，可用肉眼进行颜色的辨认以判断超标与否，其操作简单、使用方便，灵敏度比酶抑制率测定法低，因此适用于生产基地、农贸市场以及超市的一般性监测筛查。1.2.2.2 生物传感器法生物传感器通常是利用生物活性物质（如酶、抗原、抗体、细胞、组织等）作为传感器的识别元件，当活性物质与样品中的待测物发生特异性反应（如发光、发热、颜色变化、形成复合物等）时，产生的光、热等可以

28、通过信号转换器转变为电信号和光信号等，由检测器经过分析处理，实现对待测物的定性和定量检测。目前常见的有酶生物传感、免疫生物传感器、微生物传感器、细胞传感器等，按信号转化器的不同又可分为化学传感器、光导纤维生物传感器、半导体生物传感器、热生物传感器、表面等离子体共振生物传感器等。酶生物传感器是利用有机磷农药与乙酰胆碱酯酶的活性部位发生不可逆的键合从而抑制酶活性，酶反应产生的pH 值变化由电位型生物传感器检测1819。免疫生物传感器是利用抗体和抗原之间的特异性结合所产生的免疫化学反应，微生物传感器则是利用细菌、放线菌和真菌等微生物活细胞的代谢功能制成传感器检测污染物。表面等离子体共振（SPR）生物

29、传感器是利用在金属和电介质界面处入射光场在适当的条件（能量与动量匹配）下引发金属表面的自由电子相干振荡的一种物理现象，可分为棱镜耦合复合结构SPR 传感器和光纤SPR 传感器。例如，可以将已知的生物分子固定在5nm 的 Au 膜表面， 加入与其互补的目标生物分子，两者结合将使Au 膜与溶液界面的折射率上升，依据共振角改变程度对互补的目标生物分子进行定量检测。生物传感器已在环境监测、食品、医药等领域得到广泛应用，其操作方便、灵敏度高、反应时间短、仪器自动化程度高，是一种发展迅速的在线快速检测方法。但目前生物传感器技术在农残检测方面还存在稳定性和重现性差、使用寿命短等尚未解决的技术问题，短时期内还

30、无法广泛应用于农残检测中。1.2.2.3 分光光度法分光光度法是较早用于有机磷农药残留测定的方法之一。由于在分光光度法的操作过程中没有分离步骤，因此目标化合物颜色反应的特异性便成为其定量分析的主要手段。将经过前处理的样品在碱性条件下水解，产生磷酸盐，在一定酸度条件下能和钼酸铵反应，产生磷钼杂多酸，回入还原剂氯化亚锡时，磷钼杂多酸变成蓝色络合物，用分光光度计进行测定。近年来分光光度法主要集中在西维因分析上，并且对不同的样品前处理技术、不同的耦合试剂或不同的波长条件下的测定进行了研究。分光光度法用于农药残留量测量，要求进行必要的样品富集以提高灵敏度，同时操作烦琐，易受其他物质，现已经很少使用。1.

31、2.2.4 气相色谱法（GC）气相色谱是农残分析中最常见的方法之一，常用于气相色谱法的检测器主要有电子捕获检测器（ECD）、热导检测器（TCD）、氢火焰离子化检测器（FID）、氮磷检测器/碱火焰离子化检测器（NPD/AFID）、原子发射检测器（AED）等。有机磷农药不能进行分离检测。因此，在实际操作中，将有机磷农药水解，或通过衍生反应提高有机磷农药的热稳定性，达到GC对有机磷农药的测定的要求。方法快速、简便、准确，具有良好的通用性。然而学校没有NPD的检测器。1.2.2.5 气相色谱与质谱的联用（GC/MS）GC/MS是将气相色谱仪和质谱仪串联起来，成为一个整机使用的检测技术。它既有气相色谱的

32、高分离性能，又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达到同时定性、定量的目的，气相色谱离子捕获质谱法（GCITMs）是一种多残留检测方法，可用来检测土壤中的有机磷等一些污染物20。气相色谱化学电离质谱法（GCCIMS）可用来分析水果、蔬菜中多种致癌农药残量GC/MS可以减少物的影响，提高食品的灵敏度。GC/MS法不仅根据样品中待测组分在图谱上的保留时间，更主要是根据在此保留时间内残留农药裂解的特征离子碎片原理，由质谱仪按其分子量和分子结构对农药准确定性分析，并以此作为定量的依据，从而克服了由于未净化掉的杂质峰与农药保留时间重叠而造成将杂质峰误码判为农残的缺点。虽然GC/MS具有高的分享和确认能力

33、，但对于稳定性差的化合物的分析却存在一些困难。GC/MS技术在农药残留检测中已经有许多成功的实例。万益群21等用气质联用测定土壤中12种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留分析方法，该方法对0.1ug.mL-1和0.5ug.mL-1 2个尝试添加水平的回收率分别为70.1119.0%和78.1119.1%，相对标准偏差分别为6.309.80和5.208.23.刘芃岩等22大米中多种残留农药的萃取气相色谱质谱分析。该方法简便、快速、灵敏，能够满足同时测定大米中多种农药残留的要求，可以作为大米中农药多残留的例行分析和确证分析的方法。1.2.2.6 高效液相色谱法（HPLC）从1977年第一次采用HPLC柱

34、后衍生测定有机磷农药残留以来，采用HPLC柱后水解或柱后衍生方法对复杂介质中有机磷农药的残留量进行检测越来越普遍。有机磷农药的HPLC检测大多数采用反相C18或C8柱，常用的流动相为甲醇水或乙腈水。早期常用的检测手段是紫外检测器（UV）。一般说来，高效液相色谱法的检出限比气相色谱的要高。HPLC对于气相色谱法不能分析的高沸点或热不稳定的农药可以进行有效的分享检测与GC相经HPLC的流动相参与分离机制，其组成、比例和PH值可以灵活调节，这样更有利于分离。此法干扰性强、柱效高、分离能力强、安全率高、准确度和精密度好。1.2.2.7液相色谱质谱联用技术（LC/MS）LC/MS可首先由色谱将待测混合物

35、进行分离，再由质谱检测器检测，依次得到化合物的分子、离子及碎片信息，质谱数据用作化合物的确证鉴定，此过程不仅可以得到更有意义的质谱数据，而且可以在一定程度上排除基质的干扰，克服离子抑制，优化质谱检测信号。LC/MS技术是残留分析的理想检测手段。对于需要高灵敏度、宽适用范围、复杂基质的多残留特快速筛选工作而言，液质联用无疑是首选的最佳检测手段22。HPLC/MS不仅具有良好的分享和确认能力，并且能对热不稳定化全物进行更好的分析，因此HPLC/MS无疑是一个分析有机磷农药残留的解决办法。1.2.2.8其他分析方法在农药残留分析中还有活体生物检测法、免疫分析法、化学计量法、比色卡法等23。1.3 农

36、药残留分析的发展趋势随着人们对环境保护和安全卫生意识的提高，农残检测要求也越来越高。色谱分析由于其高效能的色谱柱可将各组分或杂技分离，高灵敏度和专一性强的检测器解决了早期不能检出的微量农药、代谢物和降解产物的分析，在农残的检测领域运用越来越普遍，几乎已经代替了原来的化学法、比色法和生物测定法。利用高灵敏度和高精密度分析食品及其在线联用技术来分析农药残留成为了必然趋势。在样品的制备和前处理方面也呈现出微量化、自动化、无毒化、快速化和低成本的趋势24。国外的农药残留方面的非常严格，并且有相应在的标准，相比这下，中国在这方面还较薄弱。因此应该尽快制定各行业残留标准，尽量减少有机磷农药施用量，完善农残

37、检测体系。茶叶中有机磷农药残留的测定可以用乙腈作为提取剂，超声波萃取作为前处理，用气相与质谱联用来检测。1.4 研究目的及意义茶叶是我国传统消费的具有资源优势、文化底蕴的特色农产品，2008 年我国茶园面积达161.3万公顷，茶叶产量124公顷，茶叶出口297 kt，创汇6.82亿美元，茶叶生产与出口在我国国民经济中占有重要作用，也是我国在国际市场上具有较强竞争力的出口农产品。但目前，茶叶中的农药残留问题严重影响消费者的食用安全和茶叶的出口贸易，为此，各国利用技术标准设置了各种贸易壁垒来加强对茶叶农药残留的监控和检测， 其中日本肯定列表对茶叶的设限农药残留由83种增加到约144种。然而，茶叶样

38、品前处理方法和技术已经成为农药痕量分析进一步发展的瓶颈，寻找准确高效的前处理方法一直是国际农产品和食品安全研究领域的一个重要课题。目前我国对出口茶叶农药残留的检测方法主要是采取浸渍法或均质器提取法提取，固相萃取小柱净化，气相色谱法进行测定。但是茶叶中杂质多，传统的样品前处理法存在操作复杂，过柱耗时长，成本高等缺陷，不能满足大批量样品快速检测的要求。因此，寻求检测时间短、灵敏度高、选择性强、重现性好、操作简单的茶叶农残分析技术，特别是对甲胺磷、乙酰甲胺磷、三唑磷等一些高毒高残留的茶叶农药残留的检测具有重要的意义。目前质谱是最常用的农药残留定性的手段之一，质谱作为一种通用型检测器，可以克服一般检测

39、器在多残留分析上专一性强的不足，同时应用选择离子监测技术，可提高分析的选择性，可以满足同时对各种类型的农药进行定性定量分析，近年来，质谱联用技术迅速发展，目前气质联用已被很多国际农残分析机构广泛采纳，GC/IT/MS(气相色谱/离子捕获质谱)、GC/CID/MS(碰撞诱导解离质谱)、GC/MS/MS(多极质谱串联)等技术已经广泛的应用在水果、蔬菜、茶叶等农药残留检测等领域，并获得较好的试验结果。本论文的目的是寻找一种能对茶叶中甲胺磷、乙酰甲胺磷、久效磷等有机磷农残留进行定性、定量分析的最佳方法。本文建立了超声波振荡作为前期处理，检测用GCMS联用方法。优化了超声波振荡时间，去除茶叶色素，提取剂

40、的加入量的条件。- 21 -四川理工学院本科毕业论文 实验部分第二章 实验部分2.1 实验原理质谱法的基本原理是将样品分子置于高真空（<10-3Pa）的离子源中，使其受到高速电子流或强电场等作用，失去外层电子而生成分子离子，或化学键断裂生成各种碎片离子，经加速电场的作用形成离子束，进入质量分析器，再利用电场和磁场使其发生色散、聚焦，获得质谱图。根据质谱图提供的信息可进行有机物、无机物的定性、定量分析，复杂化合物的结构分析，同位素比的测定及固体表面的结构和组成等分析。 气相色谱法是一种以气体作为流动相的柱色谱分离分析方法，它可分为气-液色谱法和气-固色谱。作为一种分离和分析有机化

41、合物有效方法，气相色谱法特别适合进行定量分析，但由于其主要采用对比未知组分的保留时间与相同条件下标准物质的保留时间的方法来定性，使得当处理复杂的样品时，气相色谱法很难给出准确可靠的鉴定结果。 所以，气质联用技术既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力。这种技术适用于未知组分的定性鉴定人可以判断化合物的分子结构，可以准确地测定未知组分的相对分子质量；可以修正色谱分析的错误判断；可以鉴定出部分分离甚至未分离开的色谱峰等。通过分离出不同的色谱峰，然后利用质谱仪自动重复扫描，给出每个峰对应的质谱图，由此推测每个色谱峰的结构组成。 2.2 实验仪器实验中使用仪器总结如下表2-1。

42、 表2-1实验仪器设备名称型号生产单位超声波清洗器AS10200B天津奥特赛恩仪器有限公司气质联用仪Trace1310TSQ8000Thermo-fisher电热鼓风干燥箱DHG-9075A天津市泰斯特仪器有限公司续表2-1设备名称型号生产单位标准检验筛目60吋 孔径0.3毫米天津奥特赛恩仪器有限公司台式低速离心机TDL40B常州国华电器有限公司分析天平CP114奥豪斯仪器（上海）有限公司氮吹仪HGC21上海禾工科学仪器有限公司2.3 实验药品2.3.1 实验药品实验中使用仪器总结如下表2-2表2-2实验药品实验药品型号规格生产单位乙腈色谱纯成都市科龙化工试剂厂正己烷液相色谱HPLC成都市科龙

43、化工试剂厂二氯甲烷分析纯重庆川东化工（集团）有限公司甲胺磷98.3%上海市农药研究所乙酰甲胺磷99.0%上海市农药研究所久效磷97.7%上海市农药研究所龙都花茶/绿茶特级四川龙都茶叶有限公司2.4 实验条件2.4.1 色谱条件（1） 色谱柱：TG1701MS（2） 填料：（14%氰丙苯基，86%二聚硅氧烷）（3） 色谱柱最大温度：260/280（4） 进样口温度：220（5） 进样模式：Split 分流（6） 载气模式；恒流 CONSTANT. Flow（7） 流速：1.200mL/min（8） 分流比：30.0（9） 扫描范围：25-300 （全扫描）定性分析（10）程序升温： 40.0 保

44、持1min 30.0/min 上升至100 保持1min 10.0/min 上升至200 保持10min2.5 实验方法2.5.1 样品前处理方法将龙都花茶研细经60目筛，准确称取2g，加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉2g吸附茶叶中的色素，再超声波振荡15min，用双层滤纸过滤，乙腈冲淋45次，取澄清滤液，用氮气浓缩吹干，加2mL正己烷定容，待上机。2.5.2标准曲线的测定分别将标准三有机磷农药配制成5ppm，10ppm，20ppm，40ppm，50ppm，100ppm的浓度梯度，按2

45、.4.1的色谱分离条件分析，找出有机磷农药对应的定量分子量的峰面积，利用峰面积和标样浓度绘制标准曲线。2.5.3 样品的测定分别取两种茶叶，按2.5.1方法处理，按2.4.1色谱条件分析测定各种茶叶中的有机磷农药的含量。2.5.4 回收率与精密度实验称取龙都绿茶27份，每份2g，分别在龙都绿茶样品中添加3种有机磷农药标液，添加水平分别为 10、 15 和20 mg/kg，每个添加水平重复3次。处理方法按2.5.1，色谱条件按2.4.1进行分析。最后求出回收率、平均回收率及相对标准偏差。回收率的计算公式为： 式中：A样品含量，单位微克（g）B测得量，单位微克（g）C加入量，单位微克（g）精密度是

46、表示测量的再现性，是保证准确度的先决条件。化学分析中，精密度是指使用特定的分析程序，在受控条件下重复分析测定均一样品所获得测定值之间的一致性程度。精密度决定于偶然误差（过失除外），表示测量结果的重现性，因此用同一样品的加标溶液重复测量，相对标准偏差（RSD）计算公式：式中：S测定结果的标准差测定结果的平均值2.5.6 检出限实验最低检出限（LOD）是在色谱图上可清楚确认的分析目的物色谱峰的下限，通常以3倍噪声（S/N=3）方法计算最低检测限。四川理工学院本科毕业论文 结果与讨论第三章 结果与讨论3.1 样品前处理方法的选择和优化3.1.1 茶叶在活性炭粉加入量的讨论取6支比支管，每支准确称取研

47、细的龙都花茶2g加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉，用来吸附茶叶中的色素，再超声波振荡5min，用双层滤纸过滤。以上6支，炭粉加入量从左往右，分别为：空白不加，0.5g，1.0g，1.5g，2.0g，2.5g。见图3-1。图3-1 活性炭粉加入量从实验结果来看，活性炭粉加入太少溶液色素太重，不适合上机检测；活性炭粉加入过多，又超成了不必要的资源浪费。2.0g茶叶加入2.0g活性炭粉就能够得到透明澄清的溶液。3.1.2 茶叶提取液的振荡时间的讨论本文采用的是超声波振荡提取对样品进行处理，不

48、同的超声提取温度会直接影响茶叶中农药的提取效率，为了确定最佳提取温度，用乙腈作溶剂，选择20、30、40和50，进行提取30 min，在30、40试验时要经常换水，防止水温的升高。实验选择25作为超声提取温度。选用再高的温度溶剂的挥发比较严重。不同的超声提取方式能直接影响溶剂与茶叶表面的接触程度，从而影响提取效果，通过实验发现采用二次提取的办法能在较短的时间内得到较好的提取效果。最终确定的方法为二次提取。取6支比支管，每支准确称取研细的龙都花茶2.0g加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉2

49、.0g，用来吸附茶叶中的色素，再超声波振荡，用双层滤纸过滤，其中，超声波振荡时间，从左往右分别为：5min，10min，15min，20min，40min，50min 。见图3-2。图3-2 茶叶振荡时间的讨论3.1.3 离心时间、转速的讨论准确称取研细的龙都花茶2g加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉2g，用来吸附茶叶中的色素，再超声波振荡15min，用双层滤纸过滤得到澄清滤液。经多次实验，当转速为4200r/min，离心时间低于10min，过滤得到的滤液不够澄清；而当离心时间设定为10

50、min，转速低于4200r/min，得到的滤液也不够澄清。实验表明离心时间在转速4200r/min，离心10min的条件下效果很好，完全能够达到实验的要求。3.2 待测有机磷农药的选择茶叶中常见的有机磷农药有：甲胺磷、乙酰甲胺磷、三唑磷、杀螟硫磷、久效磷、乙硫磷、甲拌磷等。但分析室GC-MS仪器中级性色谱柱最高温度200，所以选择的农药的沸点应该在200以下。甲胺磷：分子量141.13 沸点：高温分解 乙酰甲胺磷：分子量：183.17 沸点：147久效磷：分子量：223.16 沸点1253.3 有机磷农药定性分析将三种有机磷农药配制成浓度为50ppm，按2.4.1色谱分离条件进行分析得到色谱图

51、。色谱图上的不同的出峰时间代表不同物质。通过质谱图数据库检索，出峰时间为8.46min为甲胺磷，11.14min为乙酰甲胺磷，15.87min为久效磷。离子碎片甲胺磷为47，94，141m/z，久效磷为67，127，192m/z，乙酰甲胺磷为42，94，136m/z。色谱图和质谱图见附图1-6。3.4 样品有机磷农药定量分析3.4.1 标准曲线的绘制分别将标准三有机磷农药配制成5ppm，10ppm，20ppm，40ppm，50ppm，100ppm的浓度梯度，按2.4.1的色谱分离条件分析，找出有机磷农药对应的定量分子量的峰面积，利用峰面积和标样浓度绘制标准曲线。以峰面积为纵坐标，以浓度ppm为

52、横坐标，相关数据见表3-1，3-2，3-3，做出的曲线图见图3-3。，可看出曲线线性良好，相关系数均大于0.99。表3-1甲胺磷的浓度和峰面积浓度/ppm峰面积51020405010070001400020000320004100073000表3-2 乙酰甲胺磷的浓度和峰面积浓度/ppm峰面积51020405010090001500025000360004400090000表3-3 久效磷的浓度和峰面积浓度/ppm峰面积5102040501005000800013000210002300040000bac图3-3 三种有机磷农药的标准曲线a甲胺磷标准曲线；b乙酰甲胺磷标准曲线；c久效磷标准曲线

53、3.4.2 样品的测定将龙都花茶研细经60目筛，准确称取2g，加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉2g吸附茶叶中的色素，再超声波振荡15min，用双层滤纸过滤，乙腈冲淋45次，取澄清滤液，用氮气浓缩吹干，加2mL正己烷定容，用GCMS分析测定。由于低于检出限，没能检测出有机磷农药残留，因此，根据加标实验来测定样品中有机磷农残的含量。3.5 加标样品的测定将龙都花茶研细经60目筛，准确称取2g，加入20mL乙腈，超声振荡40min，将提取液倒入50mL塑料离心管，转速4200r/min，离心

54、10min，取上层液体，向液体中加入活性炭粉2g吸附茶叶中的色素，再超声波振荡15min，用双层滤纸过滤，乙腈冲淋45次，取澄清滤液，用氮气浓缩吹干，加2mL正己烷定容，用GCMS分析测定。测定结果见表3-5，色谱图见附录图7，图8，图9。表3-4加标样品测定农药名加标浓度/ppmGCMS测定值/ppm茶叶中农药含量/ppm甲胺磷乙酰甲胺磷久效磷10101010.004810.003610.0180.00480.00360.0183.6 方法回收率分别在龙都绿茶样品中添加3种有机磷农药标液，添加水平分别为10、15 和20 mg/kg，每个添加水平重复3次。处理出的数据见表3-5。表3-5平均回收率农药名添加水平/(mg/kg)和回收率%平均回收率%101520甲胺磷乙酰甲胺磷久效磷63.2157.8267.8562.9558.7268.4662.7860.2569.5464.3770.1369.5264.1272.5270.0263.2672.0272.3666.1872.4874.6865.7672.6275.2365.4771.6874.8864.2367.5571.393.7 精密度精密度是表示测量的再现性，是保证准确度的先决条件。化学分析中，精密度是指使用特定的分