RTCR实验步骤

1、RT - PC R 实 验 有 三 步 ： 抽 提 R N A ， R T ， PC R。1.做 RT 前必需测 RNA 浓度，逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求，常 用 500 n g 或 1 u g 。2 . R T 按 要 求 做 ， 一 般 不 会 出 太 大 问 题 。3.PCR,按常规。但如需扩长片段，贝肉前两步要求较高，需要有完整的 cDNA 存在,不是单改变 Mg2+ 浓度、退火温度能解决的。1） RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?；b：PCR 的在 RT 时,引物设计有 3 种方法即 a ： Random9mersOligodT-AdaptorPr

2、imer;和c :特异的下游引物。如果用 方法,是扩增的所有的 cDNA （理论上）,还要用此产物做问题在做 RT-PCR 遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基 因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另 一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带， 尝试其他条件同 样无法得到满意的结果，百思不得其解！ （注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的 RNA 的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！RTP C R 有 两种做法条件具备的话可用kit 进行一步法进行； 若条件不太好的话可分两

3、步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异 性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于 PCR 的进行，当然 也 可 能是我买 的 k it 不 太 好 。（ p ro m eg a） 。RTP C R 应 具 备 的 条 件高质量的RNA （保留后可做5 ，3' RACE）;引物的（最好产物短点） ；若涉及粗略定量的话还应考虑 RNA 的浓度或是 cDNA 的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将 RNA 的浓度以 及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。我做过 RACE （3' RACE 是宝生物的 Kit; 5 RACE 是

4、Gibico ）, 但现在再进行另一个同源基因的 3RACE 时却怎么也 P 不出来，这 两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列RACE 的方法），而另一个基因的 3' UTR 却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3 UTR 太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标bactin 和 GAPDH 的使用有选择性吗？比如不同的细RT-PCR内参照可以在一个管子里做 （那样也是图好看一些） ，最好分开两管， 把除了引物之外的 mixture 统一配， 拍照后， 算目的基因 和 内 参 的 比 值 ， 这 就 是 基 因 表 达 的 相 对 浓 度 。问：我曾经

5、作过同一管的 PCR，内有act in和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、 Mg2+ 加倍）。请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitity ofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplat e<(forRTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorifhedonn otknowthepreoceduremuch.butt

6、heamountjustusing"accurate piptte"iswrong.itshoudberememberedtodotheinnercontrolofh o u s e k e e p i n g g e n e e v e r y t i m e在同一管中做RT,其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶 本来就是过量的八-八，（平时做Pcr的时候，完全可以再省一些taq 酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg 就跟不能变了，一变整个体系就变了。 能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但

7、 是摸上 3、5 摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸 的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量， 所以我们不建议再同一 管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的 电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好 几封帖子里都谈了，再说一边我得观点， 1、半定量和定量 RT-PCR做的都是基因相对表达量， 不是绝对表达量， 除非你能准确知道来自 多少细胞，但是细胞还有死的呢。 2、以电泳为基础的半定量 RT-PCR本身是不可信的， 作为实验的粗筛是可以的， 但不能作为最终结果的，3、半定量 RT-PCR

8、应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表 达相同，长度差不多， GC 含量相似，或者实在穷的要省 PCR 管和关于平台期和线性期的问题， 实际上线性期是指数期， 只不过碰巧 2的冥和 2 的倍数是相同的。 看上去任何一个时期都可以， 实际上是不 对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的 文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那 些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和 buffer 之间的关系，这 种反应单靠改变其中一种成分没有用的， 酶一直是过量， 再加酶也没 用，引物 ntp 都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内

9、， 所以选一个这两种的契合点。 给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在* 帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨 内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以 用于基因组PCR ）、长度小于5 00 b P 6 00b p等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的， 要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这 样任何几个都可以拿来披，也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候， 还没发现呢， 跟不要说在基因组的位置和序列怎么考虑 内 含 子 的 问 题

10、呢 ？18s的引物也和着名的Bactin 一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA 为模板，但是比 actin 和 bubulin 等可准多了，更不要说 GAPDH 这个破烂了。 18s 除了在细胞中更相同量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因， 所以定量更加准确， 我想，不知对不对，请几位主任和 eeflying 指教。我认为，就像你 用某一种东西的数量去概括， 因该选那种多的东西， 说一座房子是由2000 块砖造成的，比说又 29 根梁更准确吧。更不要说没有看家基 因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18

11、s ,不过我们看 懂使用的那条序列， 不知有没有人用过， 告知其序列和 genbank 号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上堆。的 act in 的 荧 光探 针 还 没有 完 ， 当 初 和成 了有那位高手用过 18s 的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列） ？原位杂交最好用 RNA 做探针，效果好一些，反正你有钱卖 roche的盒子，而且量也能保证， 因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就 是 了 。 正 义 反 义 也 容 易 理 清 。我觉得做 RT-PCR 的方法和条件及应注意的事项就是那么几条 ,许多专业书都有详细的描述 ,但是许多人还是历经多次磨难，有

12、时就是得不出结果。因此， 我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同 等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性 ,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的RT PCR时，按常规方法，提取总RNA后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录， 不断改变反应条件，进行了N 次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的 PCR 的片断位于我们实验 另一位同学克隆的片断当中， 而该同学已经用 RT-PCR 克隆出她的片 断（尽管她用这些RT PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断， 然后用她的RT-PCR产物

13、作模板 （有点改进，逆转录反应换用了9 mers随机引物），用我的引进物进行一般 PCR,终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式， 书本的知识和别人的经验很重要， 但有时 也 不 定 要 受 到 书 本 框 框 和别 人 经 验 的 限 制1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和 at 含量算出吗？可用 引 物 报 告 单 上 的吗？应加多准？2PCR 时 20 微升体系中 cDNA 应加多少比较合适？ MgCl2少 ？ 各 个 成 分 的 量 有 无 确 定 标3PCR 结果跑电泳， actin 有，但跑不出目的条带，有几种

14、原因？与cDNA 的量少有关吗？ Mg 离子太多是否会抑制 Taqase 的活性？般来说引物报告单伤得是对的 ,也可以自己算 ,实际上重要的各条引物剩 下 的 可摸的20 中是指体积还是量 ?只要不明显改变体系的离子强度 ,加 1,2ul 都 可以的 .mg 要调的 ,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎 ,我都是常年不如果内参照有 ,目的没有 ,至少证明不是 "美丽惹 "的祸.原因书里应该在所有 RNA 实验中，最关键的因素是分离得到全长的 RNA 。而实 验失败的主要原因是核糖核酸酶 （RNA 酶）的污染。 由于 RNA 酶广 泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而 RN

15、A 制剂中只要存 在少量的 RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解，而所 制备的 RNA 的纯度和完整性又可直接影响 RNA 分析的结果，所以R N A 的 制 备 与 分 析 操 作 难 度 极 大 。在实验中，一方面要严格控制外源性 RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的 RNA 酶。 RNA 酶可耐受多种处理而不被灭如煮沸高压灭菌等外源性的 RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘 中。在其它分子生物学实验中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外 源性的 RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人 员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中

16、则含有大量内源性的 RNA防 止 R N A 酶 污 染 的 措 施6hr 或更长有机玻璃1.所有的玻璃器皿均应在使用前于180 C的高温下干烤2.塑料器皿可用 0.1%DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗（注意： 器 具 因 可 被 氯 仿 腐 蚀 , 故 不 能 使3. 有机玻璃的电泳槽等， 可先用去污剂洗涤， 双蒸水冲洗，乙醇干燥， 再浸泡在 3%H2O2 室温 10min ，然后用 0.1%DEPC 水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1%DE PC,在37 C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0

17、.22阿 滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置 RN A 操作专用 实验室, 所有器械等应为专用 。常 用 的 R N A 酶 抑 制 剂1.焦磷酸二乙酯（DEPC）:是一种强烈但不彻底的 RNA酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从2.异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组 织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中 解 离 出 来 ， 又 对 R N A 酶 有 强 烈 的 变 性 作 用 。3.氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA

18、酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制 RNA 酶的活性。4.RNA 酶的蛋白抑制剂( RNasin )：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。 RNasin 是 RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多 种 R N A 酶 结使其失活5.其它： SDS 、尿素、硅藻土等对RNA 酶也有一定抑制作用。mRNA分离与纯化真核细胞的 mRNA 分子最显着的结构特征是具有 5'端帽子结构(m7G)和3'端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞 mRNA的3'端存在20-30个腺苷酸组成的Poly (A)尾，通常用Poly (A+ ) 表示。这种结构为真核 mRNA 的

19、提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化 mRNA的理论基础在于此mRNA的分离方法较多，其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用 mRNA3 '末端含有 Poly( A+ ) 的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下， mRNA 被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维后，即可到较纯度的mRdT纤维醋酸31 X上样缓冲液:20mMTris-HCl(pH7.6)；0.5MNaCl；1MEDTATris-HCl(pH7.6

20、)各成分确切含量，温育（3 0 m in ) 的 1 0 % SL S至 终 浓 度 为 0 . 1 %4洗脱缓冲液:10mMTris-HCl(pH7.6)1mMEDTA(pH8.0)（p H8.0 ） ; 0. 1%SLS（十二烷基氨酸钠。配制时可先配制NaCl 、EDTA（pH8.0 ）的母液，经高压消毒后按 经混合后再高压消毒，冷却至65 C时，加入经65 C1将 0.5-1.0g 寡聚（ dT ） -纤维悬浮于 0.1M 的 NaOH 溶液中。2用 DEPC 处理的 1ml 注射器或适当的吸管，将寡聚（ dT ）-纤维 素装柱 0.5-1m l， 用 3 倍柱床体积的 DEPCH2O

21、洗柱。3 .使用1 X上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4 .将RNA溶解于DEPCH20中，在65 C中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2X上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当 RNA 上样液全部进入柱床后，再用1 X上样缓冲液洗柱，继续收5 .将所有流出液于65 C加热5min ,冷却至室温后再次上柱，收集6.用5-10倍柱床体积的1 X上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集,OD260 测定 RNA 含量。前部分收集管中流出液的 OD260 值很高， 其内含物为无Poly（A）尾的RNA。后部分收集管中流出液的 OD260，分部收集，7用 2-3 倍柱容积的洗脱缓冲液

22、洗脱 Poly（A+）RNA部 分 为 1/3体积。8管，混匀20 C 放置 30min 。OD260 测定 Poly(A+)RNA 分布，合并含 Poly(A+)RNA 的收集加入 1/10 体积 3MNaAc （pH5.2 ）、2.5 倍体积的预冷无水乙9. 4C离心，lOOOOg xi5min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。 注意：此时 Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4 C离心,10000g室温过程必CH2O溶解A。ase染。2.步骤( 4)中将RNA溶液置65 C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏 RNA 的二级结构，尤其是 mRNAPoly(A+)尾处

23、的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA 的回收率；另一个目的是能解离 mRNA 与 rRNA 的结合，否则会导 致 r R N A 的 污 染 。 所 以 此 步 骤 不 能 省 略 。3 .十二烷基肌氨酸钠盐在 18 C以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动 ， 若 室 温 低于 1 8 C 最好 用 Li Cl 替 代 N aCl 。4.寡聚(dT)-纤维素柱可在4 C贮存，反复使用。每次使用前应该依次用 N aOH 、灭菌 d d H 2O 、上 样缓冲液洗 柱。5.一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5 ggPoly(A+)RNA , 约 相 当 于

24、 上 柱 总 R N A 量 的 1 % - 2 % 。RNA 酶保护试验 (RNaseProtectionAssay,RPA) 是通过液相杂交的 方式 ,用反义 RNA 探针与样品杂交，以检测 RNA 表达的技术。与Nor thern 杂交 和 RT- PCR 比较 ，RPA 有以下几 个优点：1检测灵敏度比 Northern 杂交高。由于 Northern 杂交步骤中转 膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而 RPA 将所 有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2由于 PCR 扩增过程中效率不均一和反应 “平台”问题，基于 PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而

25、RPA 没有扩增过程，因此分析的数据真实性较高。3由于与反义 RNA 探针杂交的样品 RNA 仅为该 RNA 分子的部分 片 段 ， 因 此 ， 部 分 降 解 的 RN A 样 品 仍 可 进 行 分 析 。4步骤较少，耗时短。与 Northern 杂交相比，省去了转膜和洗膜5 RNA-RNA 杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7检测分子长度可以任意设置，灵活性大。R P A 的 缺 点 是 需 要 同 位素标记探针。1 GACUPOOL ：取 100mMATP 、 CTP、 GTP 各 2.78 Ml、1 00m M U

26、TP0 .0 6Ml， 加 D EPCH 2 O 至 1 0 0Ml 。2. 杂交缓冲液 IPES0.134g、 0.5MEDTA(pH8.0) 20 M、5MNaCI0.8ml、甲酰胺 8m l,力 口 DEP CH2O 至 10ml。3.RNase 消化液： 5MNaCl120 Ml、 1MTris-HCl(pH7.4)20Ml、 0.5MEDTA (pH8.0 )20 小 RNaseA(10mg/ml)8 讪、RNaseT1(250U/加 D E P C H 2 O 至 2 m l1 反义 RNA 可由含 T7 或 SP6 启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的 PCR 产物为模

27、板制备， 本文介绍后者。1 ) 设 计 含 T 7启 动 子 的 P C R 引 物由于 PCR 产物将作为合成反义RNA 的模板，所以一对引物中的下游 引 物 5 '端要含 T 7 启 动 子 序 列 :T7 启动子序列为：5 ' -TA ATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般 PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度，具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板 扩增出较短的片段， 以保证探针的特异性， 如下图所示：引物动子先用上游引物和下游引物I进行PCR,再以PC

28、R产物为模板，用上游引物和下游引物n -T7进行二次PCR（具体操作参见PCR章节）。3）探针合成标记与纯化在 0 . 5 m l离心管中加入下试剂R N a s i n0U/Ml)MlGACU含 GTP、CTP、ATP各 2.75mM,UTP61PUTP(10MCi2.5MlDTT(苏糖醇1M)1Mlbuer板（7RN合后，短暂心，保温加入 DNase10U/1 讪,37OC15mi n.然后75OC10min以灭se7R聚合室温下充分混匀，离心lOOOOg X2min。取上层液置另一 0.5ml离心管中，加入100 M氯仿，混匀，离心10000g X2min。将上层液转移至另一 0.5ml

29、离心管中，再加入3MNaAc10讪、预冷无水乙醇250讪，混匀后，-20OC 静置 30min。40C 离心 13500g xi0min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100讪洗涤，4OC离心13500g X2min.弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入 50讪杂交缓冲液溶解沉淀, 4OC 下保存待用。可用尿素 -聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。 (参 见本节电泳步骤1 )RN A 提取后 溶解在 杂交缓冲 液中， 浓度 为于 0.5ml(2 )取8 glRNA加入1-3讪探针(根据探针检测结果调整)2) 80OC 保温 2min ，然后 40-45OC 下杂交 12-18hr。(1) 杂交管于 3

30、7OC 保温 15min ，加入 RNase 消化液， 37OC 保温(2)加入 10%SDS10讪、10刚讪蛋白酶K20讪，混匀，37OC保温加入65讪饱和酚和65讪氯仿，混匀，室温离心，lOOOOg X2min 。(4)转移上层液到另一 0.5离心管中，加入 10 M酵母tRNA和 3MNaAc15讪，再加入200讪异丙醇，混匀后，置-20OC30min ,4 O C 离心,13 5 0 0 0 g X 10m in(5)弃上清液，室温下挥发乙醇，加入 5-8 M上样缓冲液溶解沉淀。电泳与放1)配制凝胶50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺9：16.25ml溶解后加入25% 过硫酸胺 5

31、0讪,TEMED50 M ,注入电泳槽插入梳待胶以1 XTBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达 2000v 以上，功率设定为 100w ，温度设为50OC。待胶板温度达50OC时，暂停电泳，准备加样。将已溶解在加样缓冲液中的样品 80OC 加热 2min ，立即加样到胶孔中 ， 电 泳 1 - 2 h r 。（ 电 泳 条 件 同 预 电 泳 ） 。3）电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张 X 片，盖上暗盒， -70OC 曝光1-3 天。暴光结束后，将 X光片显影、定影、水洗、晾干。1 本实验大部分为 RN

32、 A操作， 注意 RN A 酶的污染。2 RNase 消化液消化未杂交的单链 RNA 和探针 RNA ，当探针与 样品之间有碱基错配时， 错配位点也将被消化， 因此会产生片段较小 的杂交片段。因此进行 PCR 时，采取尽量减少错配的措施。3、同位素对 RNA 合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因标记时间不宜过长。4、RNase 消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液1 0 0 倍 后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内，再设计一对引物进行CR行了如果你的第一次PCR 刚好包括目的片段,那只好设计个更

33、长的了次的引物设计要求可以低点八、50二次 PCR 和巢式 PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的 PCR 产物，稀释 100-1000 倍做模板，加入底物， 从新进行扩增反应，以期增加产物的量测 OD260我做RT- PCR时，提总RNA时，都是用灭菌DE PC水，按1:100稀释后和 OD280, 后根据公式 :RNA 浓度 =OD260* 稀释度/25(ug/ul),后用 1mgtotalRNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？lu我有一个问题请教，RT-PCR要求模板 RNA的 260nm/280nm 的rote最低到

34、 1. 8，最好 2. 0，我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是R T P C R的新手，想请教引物如何设计？好 的 引 物 所 具 有 的 令 人 满 意 的 特 点 ：*典型的引物 18 到 24 个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性， 并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于 24 核苷 的引物并不意味着更高的特异性。 较长的序列可能会与错误配对序列 杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。*选择GC含量为40 %到60 %或GC含量反映模板GC含量的引物。*设计 5'端和中间区为 G 或 C 的引物。这会增加引物的稳定性和引 物 同 目 的 序

35、 列 杂 交 的 稳 定 性*避免引物对 3'末端存在互补序列， 这会形成引物二聚体， 抑制扩增。*避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个*避免 3'末端的错误配对。 3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化*避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以 加入到引物 5' 端而不影响特异性。当计算引物 Tm 值时并不包括这些 序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知 道氨基酸序列， 可以设计简并引

36、物。 简并引物是指代表编码单个氨基 酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。 为了增加特异性， 可以 参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次 黄嘌呤可以同所有的碱基配对， 降低引物的退火温度。 不要在引物的3' 端使用简并碱基， 因为 3' 端最后 3 个碱基的退火足以在错误位点起始 PCR。使用较高的引物浓度（1沏到3训），因为许多简并混合物中的 引 物 不 是 特 异 性 针 对目的模板。验 】 如 何 确 认 R N各位都知道，提取到质量良好的 RNA （包括总RNA和mRNA，以 下同）是非常困难， 关于 RNA 的提取技术， 我就不说了， 为什么呢？或许各位非常关心呢， 我是这样想的， 我可以看到的资料或者是