ISOFDIS48312006E食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水平法最大可能数技术

1、ISO/FDIS 4831:2006(E)食品和动物饲料的微生物学 大肠菌群计数水平法-最大可能数技术序ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。国际性标准的起草原则在ISO/IEC 细则第三部分中有给出。起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75成员投赞成票。国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）

2、起草的。这个第三版的ISO 4831取代了ISO 4831:1991和ISO 5541-2:1986。ISO 4831:1991的条款4、9和10已作了技术性的修改。主要的修改内容如下：在35下培养这个可选择的程序已被删除；检测和计数大肠菌群被覆盖（条况4和9）；MPN和CCT的描述被省略（条况10），可参照ISO 7218。考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4831:1991的选择性方法不受影响。绪论 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。当这个标准下一次回顾时，将会对

3、这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。本标准在技术上的描述没有ISO 4832那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，较低数量的每克或每毫升样品中的大肠菌群的数量能给出。此外，由于另外两个标准中对“大肠菌群”的定义也不一致，因此检测出的微生物含量也不一定一致。针对一些特殊的产品，方法的选择可参照相关的国际性标准。基于一个可实行的方法的目的，在条况3中给出的“大肠菌群”的定义并作

4、为操作程序的基础，并不需要与其它相关文献保持一致。在其它文献中定义的“大肠菌群”，部分通过发酵管检测并不能产气。因此本标准中的检测方法并不能用于所有其它文献中提及的“大肠菌群”。1 范围本标准给出常规的方法检测及计数大肠菌群。它可适用于：人类的食物及动物饲料；食品生产和食品处理领域的环境样品。通过液体培养基培养，温度控制在30或37，可得出最大可能值（MPN）。注意：必须注意使用的温度，牛奶或奶制品的培养温度为30。当估计每克或每毫升样品的数量在1到100之间时，可使用本标准检测。本标准的测试限度已通过大量的实践得出。在条况11中给出相关的细则。2 参考文献本标准的参考文献如下。已过期的文献，

5、后来改善或修订的，部分这种文献已经不适用。未过期的文献，最新版本都是适用的。ISO 6887（所有部分），食物与动物饲料原料微生物学样品准备原则，微生物检测样品原液及十倍法稀释第一部分：样品原液和十倍法稀释的指导准则。ISO 7218，食物与动物饲料原料微生物学微生物检验指导准则。ISO 8261，牛奶和奶制品样品原液和十倍法稀释的指导准则。ISO/TS 11133-1，食物与动物饲料原料微生物学准备和配制培养基的指导方针第一部分：实验室中培养基的配制及质控。ISO/TS 11133-2:2003，食物与动物饲料原料微生物学准备和配制培养基的指导方针第二部分：培养基配制的指导方针。3 术语和定

6、义以下术语和定义适用于本标准。3.1 大肠菌群在特殊的温度下（例如30或37），按照本标准的操作，能发酵乳糖产气的一类细菌。3.2 检测大肠菌群按照本标准操作，检测在某一类特别的产品中，大肠菌群是否存在。3.3 大肠菌群计数 按照本标准操作，得出每克或每毫升样品中大肠菌群的最大可能值。4 原理4.1 大肠菌群检测4.1.1 样品接种至选择性增菌肉汤中，30或37培养24h或48h。4.1.2 当选择性增菌肉汤出现混浊或/和产气，转接至确证培养基中，30或37培养24h或48h。4.1.3 当确证培养基中出现混浊和产气时，可证实大肠菌群的存在。4.2 MPN法计数4.2.1 当样品为液体或其它样

7、品有特定的接种量时，接种三管双倍浓度的选择性培养基。4.2.2 当样品为液体或其它样品有特定的接种量时，接种三管单倍浓度的选择性培养基。然后，后续的十倍稀释梯度同样接种三管单倍浓度的选择性培养基。4.2.3 选择性培养基试管在30或37下培养，双倍管培养24h，单倍管培养24h或48h。4.2.4 双倍管和出现混浊或产气的单倍管接种至确证培养基中。4.2.5 30或37下培养24h或48h后检查结果。4.2.6 计数确证管的产气管数，通过查表可得出每克或每毫升样品中大肠菌群的最大可能值。5 培养基与稀释液5.1 概述参照ISO 7218，ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-

8、2中准备和配制培养基，及培养基性能测试部分。5.2 稀释液参照ISO 6887（相关部分），ISO 8261 或相关的国际性标准。5.3 选择性增菌培养基：月桂醇硫酸盐胰蛋白肉汤5.3.1 成分a)双倍浓度培养基b)单被浓度培养基牛奶和动物蛋白消化酶40g20g乳糖10g5g磷酸氢二钾5.5g2.75g磷酸二氢钾5.5g2.75g氯化钠10g5g硫酸钠0.2g0.1g水1000ml1000ml5.3.2 准备溶解所有成分或培养基干粉于水中，如需要可加热。如需要，可在25调整pH值至6.8±0.2。分装培养基至试管中，每管10ml。单倍培养基试管规格为16mm×160mm，双

9、倍试管规格为20mm×200mm。121灭菌15min。必须保证灭菌后试管中不产生气泡。5.3.3 培养基质量控制参考ISO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。5.4 确证培养基：亮绿乳糖胆汁肉汤5.4.1 成分酪蛋白消化酶10g乳糖10g脱水牛胆汁20g亮绿3.3g水1000ml5.4.2 准备溶解所有成分或培养基干粉于水中，如需要可加热。如需要，可在25调整pH值至7.2±0.2。分装培养基至规格为16mm×160mm试管中，每管10ml。121灭菌15min。必须保证灭菌后试管中不产生气泡。5.4.3 培养基质量控制参考I

10、SO/TS 11133-1和ISO/TS 11133-2:2003，表B1。6 仪器设备及玻璃器皿一般的微生物实验室设备（参照ISO 7218），特别的，增加以下几项。6.1 干热灭菌和湿热灭菌设备6.2 培养箱，可恒温35±1或37±16.3 接种环，白金或铬化镍，直径大概3mm。6.4 试管，规格16mm×160mm和20mm×200mm。6.5 发酵试管，规格16mm×160mm6.6 移液器，1ml 和10ml6.7 pH计7 取样ISO 6888中并不涉及取样。如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。微生物实验室接收到的样品必须是

11、真实代表样品的，并在运输和储藏期间没有损坏或改变微生物的性状。8 样品前处理参照ISO 6887和ISO 8261 进行样品前处理。如果没有相关的国际标准，建议需经过多方同意。9 程序（见附录A）9.1 检测大肠菌群（见图1）9.1.1 试验部分和样品原液参照ISO 6887和ISO 8261和特殊产品的相关标准。9.1.2 接种和培养9.1.2.1 根据检测限要求，设液体样品原液或其它类型样品的悬液接种量为x ml，当1ml<x<10ml，接种至10ml双倍选择性增菌培养基中（5.3.1a），接种量1ml，接种至10ml单倍选择性增菌培养基中（5.3.1b）。9.1.2.2 双倍

12、培养基30或37下培养24h±2h。9.1.2.3 单倍培养基30或37下培养24h±2h。如果没有出现混浊或产生气泡，继续培养24h±2h。9.1.3 确证实验（见图A.3）9.1.3.1 接种9.1.2.2培养物一环至确证培养管中。30或37下培养24h±2h，如果没有出现混浊或产生气泡，培养至48h±2h。9.1.3.2 接种9.1.2.3呈现混浊或产生气泡的培养物一环至确证培养管中。30或37下培养24h±2h，如果没有出现混浊或产生气泡，培养至48h±2h。9.1.4 记录（见图A.2）9.1.3.1或9.1.3.

13、2培养24h±2h或48h±2h产生气泡，可视为阳性反应。9.2 计数大肠菌群（MPN）（见图A.2）9.2.1试验部分和样品原液参照ISO 6887和ISO 8261和特殊产品的相关标准。做适当的稀释梯度，确保最后一个梯度为阴性反应。9.2.2 接种和培养9.2.2.1 每一个梯度接种三管。然而，如果需要提供更加精确的数据，可增加接种管数（例如，5管）。在这种情况下，可查询ISO 7218相关MPN表。9.2.2.2 准备三管双倍选择性增菌培养基。用无菌移液管吸取10ml液体样品原液或其它类型样品悬液接种至培养基中。9.2.2.3 准备三管单倍选择性增菌培养基。使用另一个

14、无菌移液管，用无菌移液管吸取1ml液体样品原液或其它类型样品稀释液接种至培养基中。9.2.2.4 进一步的稀释梯度，按照9.2.2.3操作。每一个梯度用一个无菌移液器。小心混匀接种液于培养基。9.2.2.5 双倍培养基30或37下培养24h±2h。9.2.2.6 单倍培养基30或37下培养24h±2h。如果没有出现混浊或产生气泡，继续培养24h±2h。9.2.3 确证实验（见图A.3）9.2.3.1接种9.2.2.5培养物一环至确证培养管中。30或37下培养24h±2h，如果没有出现混浊或产生气泡，培养至48h±2h。9.2.3.2 接种9.2.2.6呈现混浊或产生气泡的培养物一环至确证培养管中。30或37下培养24h±2h，如果没有出现混浊或产生气泡，培养至48h±2h。9.2.3.3 记录（见图A.2）9.2.3.1或9.2.3.2培养24h±2h或48h±2h产生气泡，可视为阳性反应。10 计算和给出结果根据9.1.4的结果，给