抗原或抗体的检测

1、抗原或抗体的检测一、检测的原理借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体 进行定性、定量、定位的检测。1抗原与抗体的亲和力（affinity）抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激 素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇 和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不 同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反 应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重 要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗 体与抗原的结合力强，即使抗

2、原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合 物。2抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特 点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简 单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象 发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中 无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。对抗原或抗体进行定量检测时， 以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫 复物的浓度呈函数关系。（1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一 定的反应条件下，加入的已知抗体（

3、或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物 多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体浓度一定时，免 疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于 这类方法。（2）抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原 抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作 中，把浓度低的反应成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分 作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多 少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂

4、扩散法来滴定，例如将抗体浓度固 定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫 兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度（如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就 是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清（抗原）和抗体 （免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。二、抗原或抗体检测的实用意义1抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于 临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物 的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各

5、种自身抗体，对有关 疾病的诊断有重要意义。2抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类：（1）各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以 及对菌苗、疫苗的研究。（2）生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白（如各类免疫球蛋白、补 体的各种成分）、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为 抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意 义。(3)人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原(如CD抗原)、同种异型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原 等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研

6、究、对各种与免疫有关的 疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。(4)各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原， 可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动 物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在 服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应 用半抗原检测的方法。三、抗原或抗体检测的方法由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛 应用方法有下述几种：(一)沉淀反应可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合 物。在反应体系中出现不透明的沉

7、淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应(precipitation neaction)。1环状沉淀试验先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于0.5cm的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面 相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验(ring precipitationtest),此法简便易行，需用材料较多是其缺点。2单向免疫扩散试验单向免疫扩散试验(single immunodiffusion)是在凝 胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗 体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向

8、四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一 定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原 浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度(最低浓度)约 为1020卩g/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点 是需12天才能看结果(图1)图1单向免疫扩散试验示意图3免疫比浊法 当抗体浓度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼 看不见的小免疫复合物，它可使通过液体的光束发生散射，随着加入抗原增多，形 成的免疫复合物也增多，光散射现象也相应加强。免疫比浊法(immu non ephelomytry

9、)就是在一定的抗体浓度下，加入一定体积的样品，经过一 段时间，用光散射浊度计(nephelometry)测量反应液体的浊度，来推算样品中的 抗原含量。本法敏感、快速简便，可取代单向扩散法定量测定免疫球蛋白的浓度。4，双向免疫扩散试验双免疫扩散试验(double immunodiffusion)是在琼脂板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原和抗体材料。当抗 原和抗体向四周凝胶中扩散，在两孔间可出现23条沉淀线，本法常用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于两种抗原材料的抗原相关性分析(图2)。AfilA*；o oex0/0w、aAbl.bl ME图2双向免疫扩散试验示意图5.对流免疫

10、电泳 对流电泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快 速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂 板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体， 通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，向正 极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需1小时左右即可观察结果。6.免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis)的方法分成两个步骤，即 先进行电泳，再进行琼脂扩散。先将样品加入琼脂中电泳，将抗原各成分依电

11、泳速度不同而分散开。然后在适当的位置上沿电泳方向挖一直线形槽，于槽内加入含有 针对各种抗原混合抗体液，让各抗原成分与相应抗体进行双向免疫扩散，可形成多 答卷沉淀线。常用此法进行血清的蛋白种类分析。对于免疫球蛋白缺损或增多的疾 病的诊断或鉴别诊断有重要意义(图3)。原開小几内加人詩檯耻漕ilAfctlgC4. .+ _+ -t 1*1图3免疫电泳法基本步示决图7.免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting）又称为Western印迹法，用于AIDS的血清抗体检测。第一步，为电泳分离HIV抗原，在电场中根据分子量大小不同病毒抗原各成分散开。第二步，将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上（电 印

12、迹），然后将印迹有病毒抗原的硝酸纤维膜浸湿于病人血清中。如果病人血清中 含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话， 则在该抗原印迹部位形成免疫复合物沉 淀。 在洗去未沉淀的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗 体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物（如果 抗人Ig是用酶标记的）或做放射自显影（抗人Ig用1251标记）以显示结果（图4）。1宅稼分离-呈掘i护影成洗人肛消:加m捉八it图4用免疫印迹法检查患者血清中的HIV病毒抗体第一步：经电泳将HIV混合抗合抗原按分子量大小分离;第二步：将已分离的抗原经电印迹转移到硝酸纤维膜上；第三步：将待检病人血清加入

13、覆盖于硝酸纤维膜上；第四步：加入标记的第二抗体使之覆盖膜上;第五步：加入显色底物(或放射自显影)显现第二抗体(二)凝集反应细菌、红细胞或表面带有抗原的乳胶颗粒等都是不溶性的颗粒抗原，当与相 应抗体结合，抗原与抗体结合形成凝集团块，即称为凝集反应(agglutination)。1直接凝集直接凝集(direct agglutination)是将细菌或红细胞与相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。可用于传染病诊断如肥达氏反应 (Widalreaction)诊断伤寒病。或利用血细胞凝集现象检查血型。2间接凝集间接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红

14、细胞表面，与相应抗体混合出现的凝集现象。如用丫球蛋白包乳胶颗粒检测类风湿关节炎病人血清中的类风湿因子，用甲状腺球蛋白包被乳胶颗粒 用于检测甲状腺球蛋的抗体。也可以将抗体吸附到乳胶颗粒上检查临床标本中的抗 原，如细菌或真菌性脑膜炎抗体包被的乳颗粒， 一旦与含有相应抗原的脑脊液混 合，便可发生凝集， 可进行快速诊断。故凝集反应即可测定抗原，也可测抗体，方 法简便、敏感。3抗球蛋白试验 抗球蛋白试验(antiglobulin test,coombs test)的原理 为间接凝集试验。例如应用于诊断自身免疫溶血性贫血症时，Rh+X细胞与抗Rh血清间的反应。因抗Rh抗体是IgG只有两个结合价，分子较小(

15、不如IgM结合价 多，分子大)很难直接引起Rh4红细胞凝集。如果加入抗IgG的抗体，就可帮助抗Rh的IgG的抗体凝集红细胞。也就是经抗Ig的作用提高凝集反应的灵敏度。(三)补体参与抗原抗体反应这一类反应主要包括溶血反应(hemolytic assay)、补体介导的细胞毒试验(complement mediated cytotoxicuty test)及补体结合试验(complement fixation test)。1溶血反应抗体与红细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致红细胞溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应 抗体的检测， 此法比凝集反应敏感。 溶血反应也是用于抗体分泌细胞即空斑形成细 胞(PFC检测的原理。2补体介导的细胞毒试