改善植酸酶热稳定性的策略.

1、来源最适温度 (热稳定性参考文献无花果曲霉 58最高可以耐受 65的高温 Ullah 等(1998烟曲 霉 70100下加热 20min 后 ,酶活仅损失 10%Pasamontes等 (1997米曲霉 5665时酶活损失 80%张玉帧等 (1997 淀粉液化芽孢杆菌 6090处理 10min 后酶活可保留 50%Kim 等(1998 地衣芽孢杆菌 6595处理 15min 后酶活可保 留 61%Tye 等(2002枯草芽孢杆菌 5560处理 1h ,活性减少 90%Kerovuo 等(1998番 茄4560以下 ,活性很快损失李明刚等 (1998植酸酶作为一种生物型饲料添加剂 ,对提高饲料中

2、磷的利用率、动物的生产性 能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义。目前,通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲用植酸酶制剂已经基本得到实现 ,但是植酸酶制 剂应用上的另一个关键性问题 ,即酶的热稳定性始终没有得到很好解决。饲料加工 需经过制粒工艺 ,在制粒过程中有一个短暂的高温过程 ,温度一般为 7593 ,一般的 植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失 ,所以能在饲料中真正得到推广利用的 植酸酶必须具有良好的热稳定性。但另一方面 ,饲料用酶又必须在常温下具有较高 的酶活性 ,因为其最终的作用场所是在动物正常体温 (37左右的胃肠道中 ,这与工业 上所用的一些高温酶不同。这一

3、矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲用酶制剂均需 要迫切解决的问题。 1 自然选择法从嗜温微生物嗜热毁丝霉 (Myceliophthora thermophila (Mitchell 等 ,1997、土曲 霉 (As-pergillus terreus (Mitchell 等,1997、淀粉液化芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens (Oh 等 ,2001、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis (Tye 等 ,2002 中 分离到的高温植酸酶其最适温度在 7080,虽然具有很好的耐热性 ,但它在 37下的酶活性极低 ,在饲料中没有应用价值 ;相反

4、,来源于黑曲霉 (A.niger 等的植酸酶在 37下具有较高酶活性 ,但它不能经受制粒时的高温 (Ul-lah ,1998。由于耐热性是受基因控制的 ,当嗜热酶基因在常温菌细胞中表达时 , 通常会保留酶的耐热性 ,这说明嗜热菌的耐热性是可以遗传的 ,编码嗜热酶的基因是对高温适应的结果 (Zeikus 等,1998。部分植酸酶热稳定性见 表 1 。2蛋白质工程法随着基因工程技术及分子生物学技术的发展 ,蛋白质工程法逐渐成为人们研究 蛋白质稳定性的主要手段。目前在蛋白质热稳定性工程中常用的方法为:1 推理设计(rational design ;2同序概念 (consensus concept ;

5、3杂合酶 (hybrid en-zyme ;4 定向进化 (directed evolution 。 2.1推理设计推理设计主要是把热稳定蛋白改善植酸酶热稳定性的策略浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养学重点实验室付石军孙建义表 1 部分植酸酶的热稳定性摘要植酸酶作为一种生物型饲料添加剂对提高饲料中磷的利用率、动物的生 产性能以及减轻因动物高磷粪便所导致的环境水污染具有重要意义 ,但由于其热稳 定性差 ,植酸酶的推广和应用受到限制。本文综述了自然选择法、蛋白质工程法、 化学修饰法及生产工艺方面改善热稳定性的策略 ,并对其研究前景作了展望。关键词植酸酶;热稳定性;自然选择;蛋白质工程 ;生产

6、工艺中图分类号S816.7 文献标识码 A文章编号 1004-3314(200714-0026-04AbstractPhytase is a new-style enzyme used in monogastric animal feeds.It can increase phosphorus availability ,the performance of animal ,and decrease environmental phosphorus pollution.The application of natural phytase is limited due to its thermo

7、stability.The strategies of improving phytase thermostability ,with a view to discuss the research prospects were reviewed.Key wordsphytase ;thermostability ;natural selection ;protein engineering ;manufacturing technology动 物营养与热不稳定蛋白的氨基酸序列进行比较 ,分析究竟是哪些氨基酸对蛋白质的热 稳定性起关键作用。卢柏松等 (1998 对嗜热菌与常温菌的氨基酸组成做了比

8、较 ,发现 嗜热菌氨基酸中亮氨酸 (Leu、脯氨酸(Pro、谷氨酸 (Glu和精氨酸 (Arg 含量均高于常 温菌,而胱氨酸(Cys、丝氨酸(Ser、苏氨酸(Thr、谷胺酰胺 (Gln和天门冬氨酸 (Asp含 量显著低于常温菌。 Pro结构熵小,易折叠,且一经折叠 ,需要很高的能量才能解开 ,从 而提高蛋白质稳定性。 Glu 和 Arg 分别比带同样电荷的氨基酸有更大的侧链 ,侧链所 提供的疏水作用及离子间互相作用能提高蛋白质的稳定性。 Leu 具有较强的疏水性 和较大的侧链。 Jaenicki (1996对嗜热菌蛋白与常温菌蛋白进行研究 ,发现嗜热菌蛋 白与常温菌蛋白的大小、亚基结构、螺旋程

9、度、极性大小和活性中心都极相似,但由于构成蛋白质高级结构的非共价力、结构域的包装、亚基与辅基的聚集,以及糖基化作用、磷酸化作用等不尽相同而导致热稳定性不同。事实上,酶的热稳定性受到许多因素的影响 ,如氨基酸序列、三维结构、辅助因子及 pH 值等。目前普遍采用 的手段是基因定向突变 ,通过改变某个或几个氨基酸来改变蛋白质结构 ,提高热稳定 性。其中 ,脯氨酸残基在稳定蛋白质结构和提高酶热稳定性方面具有不可忽视的作 用。脯氨酸具有较大的比咯烷环 ,偏爱 -转折或无规卷曲结构 ,所以只要在主链构象 不发生聚变的情况下可在适当的 -转折或无规卷曲结构中 ,通过其刚性的比咯烷环 , 降低脯氨酸去折叠时的

10、骨架熵和肽链骨架的柔性 ,从而使周围构象更稳定、牢固。 对于植酸酶 ,可把邻近活性中心处的柔性较大的甘氨酸、苏氨酸等替换为脯氨酸 ,但 注意最好不要替换活性中心的氨基酸 ,因为脯氨酸有较大的侧链 ,有可能阻止底物的 进入,使植酸酶不表达或表达量少 （赵海霞等 ,2004。2.2 同序概念同序概念是一种半推理的方法 ,是对一组同源蛋白质的氨基酸序列 进行比较 ,以一定的标准程序计算各氨基酸序列 ,从中选择对每个氨基酸位点最保守 的残基,拼成序列,然后将最后确定的氨基酸序列翻译成相应的 DNA 序列,最后选用 合适的表达系统对这个 “人造的 ”目的基因进行表达。该方法具有以下优点 :同序基 因中的

11、每个给定的氨基酸残基与同源野生蛋白质中相应位点的氨基酸残基至少有一 个是适宜进化的 ,从而减少有害突变的冒险 ;此方法不需要了解蛋白质的三维结构 ;不 需要进行高通量的筛选。 Lehmann等（2000 把同序概念应用在真菌植酸酶家族含有 13 种不同子囊菌类的序列 ,进行同序比较计算 ,设计合成了同序植酸酶基因 fcp,构建 表达载体 pFP,在 H.polymorpha 中表达出同序植酸酶 -1。同序植酸酶 -1的最适温度 增加了 1626,而催化性质与亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同序植酸酶-1中有 5个氨基酸 Tyr31、Pro225、Met342、Phe346和 Tyr372表现增

12、加同序植酸酶 的热稳定性。晶体结构表明 ,Met342和 Phe346氨基酸残基增加疏水侧链的大小 ,导 致更紧密的疏水核 ;Tyr31 和 Tyr372 由于形成额外的氢键而增加稳定性 ;Pro225稳定 同序植酸酶的环。2.3 杂合酶把来自不同酶分子的结构单元 （二级结构、三级结构及功能域或整个 酶分子进行组合或交换以产生具有所需要性质的优化酶杂合体结构,组合出新酶 ,并可产生催化自然界不存在的反应的新酶分子为杂合酶。 Jermutus等（2001 根据黑曲 霉（A.niger植酸酶晶体结构 ,将土曲霉 （A. terreus植酸酶表面的一个二级结构 -螺旋 （66 82 区域用 A.ni

13、ger 植酸酶上相应长度的一段序列替换 ,获得了酶活性未变而热稳定性提高的新植酸酶。其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面-螺旋中氨基酸改变 ,导致疏水作用 ,增加热稳定性。同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进 化中分散在整个序列中单点突变引起的。通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源 片段改变具有很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。2.4定向进化定向进化主要包括多轮随机突变和 DNA shuffling 技术。多轮随机 突变是以目的基因进行第一轮随机突变 ,然后筛选出最佳突变子作为下一轮突变的 亲本,如此循环下去获得性状优良的突变体 (Lehmann和 Wyss,2001

14、。 DNA shuffling 技术是由 Stemmer(1994提出的 ,DNA 改组是指 DNA 分子的体外重组 ,通过改变单一 个或多个基因原有的核苷酸序列 ,创造新基因 ,并赋予表达产物以新功能。实际上是 一种分子水平上的定向进化 ,因此 ,也称为分子育种。该方法可在短时间内通过重组有效的变异体发掘所有可能的重组体与突变序列。该方法虽 然在获得有益突变体方面有很大的优势 ,但有效的筛选方法对试验的成功与否至关 重要。3化学修饰法酶的化学修饰作为一种提高酶热稳定性的重要手段 ,是酶工程研究的重要课 题。根据 X 射线晶体衍射数据 ,蛋白质分子表面约一半是由疏水氨基酸占据着。从 热力学角度

15、看 ,水溶液中疏水氨基酸与水接触对酶热稳定性不利。因此 ,通过合适的 化学修饰增加酶分子表面的亲水性 ,将有利于提高酶的热稳定性 (Mozhaev 等,1988。 不过 ,至今未找到普遍性的修饰规律 ,目前仅仅建立在分子模拟技术对修饰结果的合 理推测上。4生产工艺的改善法4.1 添加酶稳定剂通常酶在非常干燥的情况下 ,构象比较稳定 ,具有一定的耐热性 而当体系中含有一定水分或者在高温水蒸汽作用下 ,酶就极易变性失活。究其原因 , 酶的变性是由其空间三维结构的变化引起的 ,即构象发生了变化 ,从而导致酶活性中 心的结构受到破坏 ,使其催化能力降低或丧失。在热作用下 ,酶蛋白的热作用时间越长 ,酶

16、失活越严重。氢键在维持酶的空间构象中起着重要的作用 ,当体系中含有大量 的自由水时 ,就会破坏酶分子内部的氢键 ,使酶分子构象容易发生变化 ,酶就易于变性 失活。在颗粒饲料制粒过程中酶制剂经历的正是高温、高湿和高压的环境,因此 ,在改善酶的热稳定性方面 ,不仅应考虑改善酶的热稳定性 ,还应考虑提高其耐湿性。多 羟基化合物、食用胶、盐、氨基酸等盐类的添加剂能明显的改善酶的热机械稳定性 和耐热性。盐类主要存在离子键作用 ,当酶的活性中心含有离子作为配位体时 ,盐离 子就能稳定酶的构象。另外盐可作为水分子的替代物占据水的位置,排除自由水对酶造成的不稳定化影响。酶液中海藻糖、蔗糖的添加也能改善酶的热稳

17、定性。海藻糖作为一种多元醇化 合物 ,可通过氢键与酶蛋白表面分子相连接 ,使酶蛋白分子稳定。为了保持液体酶的 活力,国内外大多采用在浓缩液中添加金属离子、多元醇、多糖类化合物等方法。4.2 制备包被型颗粒包被型饲用植酸酶颗粒酶活高 ,热稳定性好 ,在饲料工业中取 得了广泛的应用。其制备过程大致如下 :基因工程菌发酵获得的植酸酶溶液 ,经过滤 和超滤以后获得植酸酶浓缩溶液 ,把浓缩溶液与淀粉、水溶性的无机盐和无机物按 一定的配比混合 ,均匀糅合成面团状 ,经挤压、切割、圆整 ,制成小颗粒 ,再经低温气流 干燥、筛分 ,获得直径适中的含酶颗粒。颗粒直径一般控制在 0.21.6mm;然后选用 一些合

18、适的水不溶物 ,按一定的比例喷涂在颗粒表面 ,经低温干燥后制成包被型含酶 颗粒。经调质温度 85处理 30 s,酶活性保留率达到 70%左右（陆文清等 , 2000。5研究展望植酸酶作为新型生物添加剂 ,应用范围广 ,需求量大 ,而且它对减少环境污染和保 护生态环境具有重要意义。今后应深入研究植酸酶基因的结构与热稳定性的关系 , 对热稳定性基因进行功能定位 ;综合运用蛋白质热稳定性工程中的各种方法 ,筛选出 可快速、有效获得突变体的 ;选择合适的酶制剂加工工艺 ,确保植酸酶在加工过程中 损失最小。参考文献1 李明刚,郝亚桓,但野利秋 .番茄植酸酶分离提纯及其特性研究 J.烟台大学学 报 (自然

19、科学与工程版 ,1998,11(4:258266.2 卢柏松 ,王国力,黄培堂 .嗜热与嗜常温微生物的蛋白质氨基酸组成比较 J.微 生物学报 ,1998,38(1:2025.3 陆文清 ,李德发,武玉波 .介绍两种提高饲用酶制剂热稳定性的方法 J.粮食与 饲料工业 ,2000,12:3435.4 张玉帧 ,林学政,吴志宏 ,等.植酸酶高活性菌株的选育及酶性质的初步研究 J. 山东大学学报 (自然科学版 ,1997,32(4:466471.5 赵海霞 ,王红宁,陈惠.饲用植酸酶热稳定性的研究 J.微生物学通报 , 2004,31(1:105109.6 Jaenicki R.Stability a

20、nd folding of ultrastable proteins:eye lens crystallins and enzymes from thermophilesJ.The FASEB Journal,1996,10(1:8492. 7Jermutus L,Tessier M,Pasamontes L,et al.Structure-based chimeric en-zymes as an alternative to directed enzyme evolution:phytase as a test caseJ.J Biotechnol,2001,85(1:1524.8 Ker

21、ovuo J,Lauraeus M,Nurminen P,et al.Isolation,Characterization, Molecular Gene Cloning,and Sequencing of a Novel Phytase from Bacillus subtilisJ.Applied and Environmental Microbiology,1998,64(6:20792085.9 Kim Y O,Kim H K,Bae K S,et al.Purification and properties of a ther-mostable phytase from Bacill

22、us sp.DS11J.Enzyme and Microbial Technolo-gy,1998,22:27.10 Lehmann M,Kostrewa D,Wyss M,et al.From DNA sequence to im-proved functionality:using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytaseJ.Protein Engineering,2000,13(1:4957. 11Lehmann M,Pasamontes L,Lassen S F,et

23、al.The consensus concept for!黄酮组的肉鸡饲料转化率高于未添加组 (P <0.01。王国杰和韩正康 (1994报道 , 给 32 日龄红布罗肉鸡日粮中添加 3mg/kg 大豆黄酮 ,可提高日增重 10.1%(P <0.01;给 4556日龄红布罗肉用公仔鸡日粮中添加 4.38mg/kg 红三叶总异黄酮 ,与对照组相比 日增重提高 5.1%,料重比下降 9.2%。同时,王国杰等 (1995给大鼠皮下注射大豆黄酮 16d ,雄性去势大鼠的 RNA 含量比对照组提高 15.0%(P <0.05,每克肌肉组织中 DNA 含量比对照组下降 14.0%(P &

24、lt;0.05,RNA/DNA 比值提高 18.7%,表明大豆黄酮的促肌 肉生长作用主要是肌纤维的营养性肥大和蛋白质合成代谢加强,而不是加速卫星细胞繁殖的结果。同时 ,血清尿素氮含量显著下降 ,说明蛋白质分解代谢下降 ,动物机体 氮储留增加 ,所以大豆黄酮使雄性动物肌肉蛋白质累积增加与蛋白质合成过程的加 强和分解代谢的下降有关。刘燕强和韩正康 (1998 发现,饲喂大豆黄酮母鸡产蛋率显 著提高(P <0.05,且蛋重有提高的趋势 ,饲料转化率也有所提高。尹靖东等 (2002报道, 在蛋鸡日粮中添加大豆黄酮或茶多酚可提高产蛋率。 5生物类黄酮研究开发的前景近年来 ,虽然提取、分离生物类黄酮

25、的研究比较多 ,但对其活性机理、在动物体 内吸收代谢机制、稳定性等方面研究仍然较少 ,如蛋白质对生物类黄酮的减效作 用、维生素 E 对生物类黄酮的增效作用、类黄酮与肠道菌类的关系等都有待于今后解决。加强这方面的理论研究工作 ,可以加速生物类黄酮资源的开发与利用 ,生物类黄酮的开发与利用对于开发新的饲料资 源和促进动物生产都有着积极的意义。参考文献1 戴尧天 ,张昭,高子芬 .刺梨降低鹌鹑血脂和阻断动脉粥样硬化形成的作用 J. 营养学报 ,1994,16(2:201204.2 胡春,丁霄霖 .黄酮类化合物在不同氧化体系中的抗氧化作用研究 J.食品与发 酵工业 ,1996,3:4653.3 林实秋

26、 ,陈吉棣.山楂及山楂黄酮预防大鼠脂质代谢紊乱的分子机制研究 J.营 养学报 ,2000,22(2:131136.4 刘燕强 ,韩正康.异黄酮植物雌激素 -大豆异黄酮对产蛋鸡生产性能及其血液中 几种激素水平的影响 J.中国畜牧杂志 ,1998,34(3:910.5王国杰,韩正康,陈伟华 .大 豆黄酮对大鼠肌肉生长和几种内源激素水平的影响 J.动物学研究 ,1995,16(1:2329.6王国杰 ,韩正康.红三叶草总异黄酮对小公鸡生长及血清睾酮水平的影响 J.动 物学研究 ,1994,15(3:6569.7 谢棒祥 ,张敏红,杜荣,等.类黄酮对肉仔鸡生产性能及脂质代谢的影响 J.动物 营养学报

27、,2002,14(4:4953.8 谢棒祥 ,张敏红.生物类黄酮的生理功能及其应用研究进展 J.动物营养学 报,2003,15(2:1115.9 尹靖东 ,齐广海,霍启光 .类黄酮对蛋鸡脂类代谢的影响 J.畜牧兽医 报,2002,33(3:215220.10 余杰,陈美珍 .亮叶杨桐中类黄酮提取及其抗氧化、抑菌作用的研究 J.汕头 大学学报 ,1997,12(2:5258.11 张荣庆,韩正康,陈杰,等.大豆黄酮对母猪免疫功能和血清及初乳中 GH 、PR L 、 SS 水平的影响 J.动物学报 ,1995,41(2:201206.12 张荣庆 ,韩正康 .黄酮类化合物对小鼠免疫功能和血中 -内

28、啡肽水平的影响 J.中国免疫学杂志 ,1994,10:9192.13 Kirk E A ,Herland P S ,Wang S A ,et al.Dietary iso-flavones reduce plas-ma cholesteroland at herosclerosis in C57BL/6mice but not LDLre-ceptor-deficient mice J.J Nutr ,1998,128:954959.通讯地址 :山东省滨州市邹平县六和饲料股份有限公司邹平分公司 ,邮 编:256200thermostability engineering of proteins

29、 J.Biochim BiophysActa ,2000,1543(2:408415.12Lehmann M ,Wyss M.Engineering proteins for thermostability :the use of sequence alignments versus rational design and directed evolution J.Protein technology and commercial enzymes ,2001,12:371375.13Mitchell D B ,Vogel K ,Weimann B J ,et al.The phytase su

30、bfamily of his-tidine acid phosphatases :isolation of genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora thermophila J.Microbilology ,1997,143:245252.14 Mozhaev V V ,Siksnis V ,Melik-Nubarov N S ,et al.Protein stabilization via hydrophilization.Covalent modification of trypsin and alpha-chymotrypsin J.Eur J Biochem ,1988,173:147154.15 Oh B C ,Chang B S ,Park K H ,et al.Calcium-Depen