大肠菌群和大肠杆菌检测方法

1、1出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for examination of coliform ， fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 92代替 ZB X09 002 861主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。2设备和材料2.1 吸管：1mL，具 O.ImL 刻度；5mL 和 10mL，具 1mL 刻度。22 水浴箱：44.5 .5C。2.3 培养箱：361C,44.5 .5C。2.4 冰箱：05C和-15-

2、20Co2.5 均质器。2.6 乳钵和研棒。5.2.3 平皿：直径 90mmo5.2.4 天平：感量 0.1go2.9 显微镜。2.10 稀释瓶：100mL、200mL 和 500mL 三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约 5mmo2.12 菌落计数器。3培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤。3.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤。3.3 EC 肉汤。3.4 伊红美蓝琼脂 （EMB）o3.5 营养琼脂斜面。3.6 色氨酸肉汤。6.1 MR-VP 培养基。6.2 Korser 氏枸椽酸盐肉汤。6.3 结晶紫中性红胆盐琼脂 （VRBA）o6.4Butterfield 氏磷酸盐缓

3、冲稀释液。3.11 生理盐水。3.12 革兰氏染色液。3.13 Kovacs 氏靛基质试剂。3.14 甲基红指示剂。3.15 Voges pros kauer（V P）试剂。4样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于 4C冰箱保存。检验前冷冻样品可于2 5C18h 内解冻，或在 45C以下 15min 内解冻。6.4 不同食品样品匀液的制备7.2液体食品以灭菌吸管取样 25mL 放入装有 225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶 （瓶内预置适当数量的玻璃珠），以 30cm 幅度、于 7s

4、2内振摇 25 次（或以机械振荡器振摇），制成 1 : 10 的样品匀液。7.3固体和半固体食品以无菌操作取 25g 样品，放入装有 225mL 稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/ min 均质 12min，制成 1: 10 样品匀液 （也可用灭菌乳钵研磨的方法代替 ）。6.5稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计， 用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如 10-2、10-3、10-4.。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。5 大肠菌群的测定7.4.2 大肠菌群 MPN 值的测定8.1对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐

5、胰蛋白（LST）肉汤，每管接种 1mL 。5.1.2 将接种管置于 361C培养 482h。5.1.3 观察试管的产气情况： 检查倒管内是否有气泡产生，记录在 24h 和 48h 内产气的 LST 肉汤管数。如所有 LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。7.4.3 大肠菌群的证实试验8.2.3 将所有产气管用直径为 3mm 的接种环移种到煌绿乳糖胆盐 （BGLB） 肉汤管中。5.2.2 置 BGLB 肉汤管于 36 1C培养 482h。8.2.5 记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。5.2.4 结果报告：按 BGLB 肉汤产气管数，查 MPN 表（见附

6、录 B（补充件）报告每克（毫升）样品中大肠菌群的 MPN 值。6 粪大肠菌群测定a.用直径为 3mm 的接种环将所有 482h 内产气的 LST 肉汤管培养物移种于 EC 肉汤管中。6.2 将所有接种的 EC 肉汤管在 30min 内放入带盖 44.55C水浴箱内，培养 242h。水浴箱的水平面应高于肉汤 培养基液面。应以已知为 44.5C产气阳性的大肠杆菌和44.5C不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3 记录 EC 肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。结果报告：按产气管数，查 MPN 表报告每克 （毫升 ）样品中粪大肠菌群的 M

7、PN 值。7大肠杆菌测定7.1 将 6.3 条中的 EC 肉汤管继续培养 24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，361C培养242h。检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2 个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，361C培养 1824h。将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1 色氨酸肉汤：在 361C培养 242h 后，力口 Kovacs 氏试剂 0.20.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。MR VP 培养基；在 361C培养

8、482h。以无菌操作移取培养物 1mL 至 13mrtK 100mm 试管中，力口 5%a萘酚乙醇溶液 0.6mL，40%氢氧化钾溶液 0.2mL 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置 2h，如出现伊红色，为 VP 试 验阳性。将 MRVP 培养物的剩余部分再培养48h 滴加 5 滴甲基红溶液。 如培养物变红色， 为甲基红试验阳性， 若变黄色则为阴性反应。Koser 氏枸椽酸盐肉汤：于361C培养 96h 记录有无生长。LST 肉汤：于 30 1C培养 482h，观察试管中是否产气。7.4.5 革兰氏染色：取 18h 营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6 大肠杆菌与非大肠

9、杆菌生化鉴别如下：靛基质MRVP枸椽酸盐鉴定（型别）+- 典型大肠杆菌3+-+-+-+如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气， IMViC 试验为 +-或-+- ，再根据 LST 肉汤阳性管数查MPN 表，报告每克 （毫升 ）样品中大肠杆菌 MPN 值。8大肠菌群固体培养基测定法样品制备同第 4 章计数8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿 1mL 。另取 lmL 稀释剂加入一 个灭菌平皿中，作空白对照。822 将冷至 450.5C的结晶紫中性

10、红胆盐琼脂（VRBA）1015mL 倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后，再加 3 4mLVRBA 覆盖平板表层。8.2.4 翻转平板，置于 36C培养 1824h。选用有 30150 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红 色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。证实从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，移种于 BGLB 肉汤管内，361C培养 24h 和 48h,观察产气情况。将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。结果报告经最后证

11、实为阳性 （产气， 革兰氏阴性杆菌 ）的试管百分比乘以于， 再乘以稀释倍数， 即为每克 （毫升 ）样品中大肠菌 群数。例：10-4 样品稀释液 lmL，在 VRBA 平板上有 100 个典型和可疑菌落，挑取其中10 个接种 BGLB 肉汤管，证实有 6 个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10X104/g(mL)=6.0M05/g(mL)附录 A 培养基和试剂（ 补充件 ）A1 月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤胰蛋白 或胰酪胨 （Trypticase）20g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾 (K2HPO4)2.75g磷酸二氢钾 (KH2P04)2.75g月桂基硫酸钠0.1g蒸馏水1

12、000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的最终 pH6.80.2。A2 煌绿乳糖胆盐 （BGAB） 肉汤 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g-非典型大肠杆菌+典型中间型+非典型中间型+典型产气肠杆菌+非典型产气肠杆菌20mrX150mm 试管中，每管 10mL。121C高压灭菌 15min4牛胆粉 (oxgall 或 oxbile) 溶液 200.0mL0.1煌绿水溶液13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约 500mL 蒸馏水中，加入牛胆粉溶液 200mL(将 20.0g 脱水牛胆粉溶于 200mL 蒸馏水中，pH7.0 7.5)，用蒸馏水稀释到 975mL ,调 pH7.4。

13、 再加入 0.1 %煌绿水溶液 13.3mL ,用蒸馏水补足到 1000mL， 用棉花过 滤后， 分装到 20mrW150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管 10mL。121C高压灭菌 15min。最终 pH7.20.1。 A3 EC 肉汤胰蛋白 或胰酪20.0g3 号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾 (KH2P04)4.0g磷酸二氢钾 (KH2P04)1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mrW150mm 试管(管内有倒立的小发酵管)，每管 8mL。121C高压灭菌 15min，最终 pH6.9 )。1。A4 伊红美蓝琼脂 (EMB)

14、蛋白胨10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾 (KH2P04)2.0g琼脂15.0g伊红Y水溶性)0.4g 或 2%水溶液 20mL美蓝 0.065g 或 0.5%水溶液13mL蒸馏水1000.0mL在 1 000mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、 磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶 100mL 或 200mL， 高压灭菌 15min。最终 pH7.1 0.2。使用前将琼脂融化，于每 100mL 琼脂中加 5mL 灭菌的 20%乳糖水溶液、2mL 的 2%伊红Y水溶液和，摇匀，冷至 4550C倾注平皿。A5 营养琼脂斜面牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mL

15、将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121C高压灭菌 15min。最终 pH7.30.1。灭菌后摆成斜面备用。A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 10.0g蒸馏水 1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mLo121C高压灭菌 15min。最终 pH6.90.2。A7 MR-VP 培养基胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾 (K2HPO4) 5.0g5蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121C高压灭菌 15min，最终 pH6.90.2。A8 Koser 氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠 (NaNH4HPO4?4H2O) 1.5g磷酸氢二钾 (K2H

16、PO4)1.0g硫酸镁 (MgSO4?7H2O)0.2g枸椽酸钠 (含 2H2O)3.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL, 121C高压灭菌 15min。最终 pH6.70.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖 10.0g氯化钠5.0g胆盐或 3 号胆盐 1.5g中性0.03g结晶紫0.002g琼脂1518g蒸馏水1000.0mL将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至 pH7.40.1。煮沸 2min，将培养基冷 4550C倾注平板。临用时制备，不得超过 3h 。A1O Butterfield 氏磷酸盐缓

17、冲稀释液贮存液磷酸二氢钾 (K2HPO4)34.0g蒸馏水500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用lmol / L 氢氧化钠约 175mL 调至 pH7.2。用蒸馏水加至 1000mL 贮存于冰箱。稀释液取贮存液 1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后，121C高压灭菌 15min。A11 生理盐水氯化钠8.5g蒸馏水1000.0mL将氯化钠溶于蒸馏水中，121C高压灭菌 15min。A12 革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫1.0g95乙醇20.0mL1 草酸铵水溶液80.OmL将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液：碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.

18、0mL将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL 。沙黄复染液：沙黄 0.25g695乙醇10.0mL蒸馏水 90.0mL 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。染色法将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min ，水洗。滴加革兰氏碘液，作用lmin ，水洗。滴加 95 %乙醇脱色约 1530s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗 d 滴加复染液，复染 lmin ，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。A13 Kovacs 氏靛基质试剂对二甲氨基苯甲醛5.0g戊醇 75.0mL盐酸 (浓)25.0mL将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。A14 甲基红指示剂甲基红 0.1g95%乙醇300mL将甲基红溶解于 300mL 乙醇中，加水稀释至500mL 。A15 V oges Proskauer(V P)试剂甲液a-萘酚5.0g无水乙醇100.0mL乙液氢氧化钾40.0g用蒸馏水加100.OmL附录 B1g 检样中最近似值(MPN)表( 补充件 ) 使用三管法，接种量分别为 0.1， 0.01 和 0.00lg。阳性管数MPN阳性管数MPN0.10.010.0010.10.010.0010001100注：本表采用3 个稀释度 0.1g(mL) 、0