分子生物学实验-实验2重组质粒的提取及鉴定ppt课件

1、1实验二重组DNA的提取及酶切鉴定复旦大学根底医学院医学实验教学中心复旦大学根底医学院医学实验教学中心邵红霞邵红 2一、实验目的掌握以下方法和技术：掌握以下方法和技术： 1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备 2. 质粒质粒DNA的限制性内切酶酶切的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3二、实验原理 分别质粒分别质粒DNA有三个步骤：有三个步骤：1. 培育细菌使质粒扩增培育细菌使质粒扩增2. 搜集和裂解细菌本实验：搜集和裂解细菌本实验：SDS裂解裂解3. 分别和纯化质粒分别和纯化质粒DNA本实验：碱变

2、性本实验：碱变性法法1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备4碱变性法抽提质粒碱变性法抽提质粒DNASolution IIpH12.6Solution IIIpH4.8离心后去向离心后去向染色体染色体DNA氢键断裂，双氢键断裂，双螺旋解开螺旋解开不能复性不能复性沉淀中沉淀中质粒质粒DNA氢键部分断裂，氢键部分断裂，cccDNA互补链互补链不完全分离不完全分离复性复性上清中上清中5硅基质资料硅基质资料(树脂与树脂与DNA双链相互作用的原理双链相互作用的原理 DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链得暴

3、露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸分子一旦被硅胶吸附，普通的洗液不能将其洗脱下来，只需水溶性的缓冲液，附，普通的洗液不能将其洗脱下来，只需水溶性的缓冲液，如如TE或水重新水化后，或水重新水化后，DNA才干从层析柱上定量回收。才干从层析柱上定量回收。6 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切BamH I + Xba I双酶切酶切完双酶切酶切完全时全时琼脂糖凝胶电泳凝胶中琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带条区带3.5kb pSV2载体片段载体片段4.8kb c-myc 目的基因片段目的基因片段pSV-c-mycBamH IXba Ic-myc基因片段基因片段4.8 kbpSV2载体片段载体片段

4、3.5kb7琼脂糖琼脂糖海藻中提取的线状高聚物海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶凝固后成凝胶3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳89DNA在凝胶中的迁移率的影响要素 DNA分子的大小分子的大小 琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 DNA的构象的构象 所加电压所加电压 嵌入染料的存在嵌入染料的存在 电泳缓冲液的组成及其离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度1011不同含量规范的琼脂糖凝胶的分别范围不同含量规范的琼脂糖凝胶的分别范围琼脂糖凝胶浓度线状琼脂糖凝胶浓度线状 DNA分子分别范围分子分别范围 %，m/V kb 0.3 560 0.5 130 0.6

5、 120 0.7 0.812 1.0 0.510 1.2 0.46 1.5 0.24 2.0 0.1312 质粒质粒DNA的的3种构象种构象琼脂糖凝胶电泳凝胶中琼脂糖凝胶电泳凝胶中1、2、3条带都有能够条带都有能够共价闭合环形共价闭合环形DNA开环开环DNA线性线性DNA存在复制中间体能够存在复制中间体能够13DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液141%琼脂糖凝胶电泳中：琼脂糖凝胶电泳中：溴酚蓝迁移速率约与溴酚蓝迁移速率约与300bp的线状双链的线状双链DNA一样；一样；二甲苯氰二甲苯氰FF约与长约与长4000bp的的DNA一样一样添加样品密度，以确保添加样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔里均匀进入样

6、品孔里使样品呈现颜色使样品呈现颜色在电场中可预知速率向阳极涌动的染料在电场中可预知速率向阳极涌动的染料15三、实验器材与试剂详见实验讲义16四、实验步骤四、实验步骤详见实验讲义详见实验讲义1. 质粒质粒DNA的小量快速制备的小量快速制备AXYGEN AxyPrep质粒质粒DNA小量制备试剂小量制备试剂盒本卷须知：盒本卷须知： 1. 初次运用前，将初次运用前，将RNaseA全部参与全部参与Buffer S1中，中，4 储存储存 2.初次运用前，初次运用前，Buffer W2 concentrate 中参中参与指定体积的无水乙醇与指定体积的无水乙醇 3. 运用前检查运用前检查Buffer S2能否

7、出现沉淀，假能否出现沉淀，假设有应在设有应在37加热溶解并冷却至室温运用加热溶解并冷却至室温运用 4. 自行预备无核酸和核酸酶污染的自行预备无核酸和核酸酶污染的tip头和头和离心管离心管 5. Buffer S2运用后立刻盖紧瓶盖，以免空运用后立刻盖紧瓶盖，以免空气中的气中的CO2中和中和Buffer S2中的中的NaOH，降，降低溶菌效率低溶菌效率17将细菌培育物全部倒入将细菌培育物全部倒入15ml离心管，离心管，4500rpm，5min加加250 l Buffer S1，吹打混匀也可，吹打混匀也可Vortex以充分悬浮细菌，转入以充分悬浮细菌，转入1.5ml离心管离心管加加250 l Bu

8、ffer S2，上下颠倒，温暖混匀，上下颠倒，温暖混匀46次使菌体裂解次使菌体裂解加加350 l Buffer S3，上下颠倒，温暖混匀，上下颠倒，温暖混匀68次，次，12000g 离心离心10min汲取上清至已置于汲取上清至已置于 2ml 离心管的制备管中，离心管的制备管中，12000g离心离心1min，弃滤液，弃滤液同上，在制备管中加同上，在制备管中加500 l Buffer W1， 12000g离心离心1min ，弃滤液，弃滤液在制备管中加在制备管中加700 l Buffer W2， 12000g 离心离心1min ，弃，弃滤液，反复以滤液，反复以Buffer W2洗涤离心一次，再空离心

9、洗涤离心一次，再空离心1次次将制备管移入新的将制备管移入新的1.5ml离心管，在膜中央加离心管，在膜中央加60 l Eluent或去或去离子水，室温静置离子水，室温静置1min， 12000g离心离心1min，即为质粒，即为质粒DNA。防止猛烈摇摆，此步骤不宜超越防止猛烈摇摆，此步骤不宜超越5min防止猛烈摇摆防止猛烈摇摆Eluent液液65度温育可提高洗脱效率度温育可提高洗脱效率请坚持同步！请坚持同步！离心机配平离心机配平弃上清，沥干，留意细菌沉淀别倒掉了！弃上清，沥干，留意细菌沉淀别倒掉了！182. 质粒质粒DNA的限制性内切酶的双酶切的限制性内切酶的双酶切Buffer 4 2 lBamH

10、(20U/ l) 1 lXba(20 U/ l) 1 ldd H2O 10l质粒质粒DNA 6l 20 l混匀后短暂离心，混匀后短暂离心，37 水浴水浴1小时小时留意：留意：加样顺序加样顺序保证每样试剂参与反响体系保证每样试剂参与反响体系乙酰化乙酰化BSA可不加可不加加样完成后需混匀，短暂离心加样完成后需混匀，短暂离心反响终了后，上样电泳前需短暂反响终了后，上样电泳前需短暂离心，再加凝胶加样缓冲液离心，再加凝胶加样缓冲液及时将酶放回及时将酶放回-20 冰箱以保证酶冰箱以保证酶的活力的活力19预备好制胶器，插好梳子预备好制胶器，插好梳子并保证梳子距底部并保证梳子距底部0.5mm-1.2mm灌胶事

11、先加灌胶事先加GelRed留留意赶气泡意赶气泡待凝待凝预备好凝胶，加热熔解预备好凝胶，加热熔解20本卷须知：本卷须知：标液面高度以察看水分能否蒸发过标液面高度以察看水分能否蒸发过多，假设溶解后水分蒸发过多，多，假设溶解后水分蒸发过多，补水补水2. 三角烧瓶上覆打过洞的保鲜膜三角烧瓶上覆打过洞的保鲜膜防水蒸发防水蒸发防爆沸和烫伤带手套防爆沸和烫伤带手套加加6l GelRed后立刻灌胶戴手套后立刻灌胶戴手套称量称量agarose参与参与TAE 60ml，勿晃，勿晃微波炉溶胶微波炉溶胶留意先做好制胶预备！留意先做好制胶预备！1%agarose凝胶1%agarose凝胶21在电泳槽内加电泳缓冲液在电泳

12、槽内加电泳缓冲液拔去加样梳，将制好的凝拔去加样梳，将制好的凝胶连同内架放入电泳槽内，胶连同内架放入电泳槽内，保证液面高于凝胶面保证液面高于凝胶面参与参与6 凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液和和DNA1:5比例混合比例混合依次加样，并加好依次加样，并加好Marker连通电源，连通电源，80V电泳至溴电泳至溴酚蓝带到达凝胶的酚蓝带到达凝胶的1/2处处结果察看和记录结果察看和记录DNA从阴极向阳极迁移从阴极向阳极迁移EBr从阳极向阴极迁移从阳极向阴极迁移加样后不能挪动电泳槽！加样后不能挪动电泳槽！22凝胶成像及分析系统凝胶成像及分析系统233. DNA的的1%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制胶：制胶：1%

13、 agarose 1% agarose ，防过热暴沸，防过热暴沸上样预备上样预备 1 1份凝胶加样缓冲液加份凝胶加样缓冲液加5 5份份DNADNA上样和电泳上样和电泳: : 每组上样每组上样2 2个个 未酶解质粒和双酶切产物未酶解质粒和双酶切产物 未酶解质粒未酶解质粒10 l +2 l10 l +2 l凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 双酶切产物双酶切产物20 l +4 l20 l +4 l凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液 Marker5l, Marker5l, 放中间，放中间，2 2组组1 1块胶块胶 各组先做好预备，两组一致集中上样后电泳各组先做好预备，两组一致集中上样后电泳 电泳槽和电泳仪不可挪

14、动电泳槽和电泳仪不可挪动24 未酶切酶切未酶切酶切Marker10 l+2 l 20 l +4 l10 l+2 l 20 l +4 l5 l4. 结果察看和记录结果察看和记录80100V电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的电泳，直到溴酚蓝带泳动到凝胶的1/2至至2/3处处停顿。停顿。紫外灯下察看，拍照记录。紫外灯下察看，拍照记录。上样图示：上样图示：25预期结果预期结果未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切实验组双酶切对照组双酶切未酶切质粒Marker26未酶切质粒对照组双酶切实验组双酶切DNA/Hind Marker-23130-9416-6557-4361-2027-23221%agarose凝胶电

15、泳27发散性思索：发散性思索：为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆一个细菌来为何细菌平板上的长出的细菌集合是单克隆一个细菌来源的？请例举能够的解释来支持或反对这一说法。源的？请例举能够的解释来支持或反对这一说法。为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理上解释，从为何线性的质粒不易转入细菌内，如何从机理上解释，从实验中证明？衔接时能否会出现多聚体？实验中证明？衔接时能否会出现多聚体？思索与疑问：思索与疑问：做感受态时，为何要在冰浴下进展？能否还有其他能够缘由做感受态时，为何要在冰浴下进展？能否还有其他能够缘由 为了让细胞膜流动性降低，利于为了让细胞膜流动性降低，利于DNADNA的结合，同时使细胞暂停生长，的结合，同时使细胞暂停生长，维持在对数生长期的高活性维持在对数生长期的高活性 全程在冰浴下进展，反复冻融会使细菌细胞破裂全程在冰浴下进展，反复冻融会使细菌细胞破裂2. 2. 为何细菌平板倒过来生长更好？能否还有其他能够缘由为何细菌平板倒过来生长更好？能否还有其他能够缘由 微生物培育时普通培育基中的水分含量较高，且培育温度普通较高，微生物培育时普通培育基中的水分含量较高，且培育温度普通较高，假设不将培育皿翻转，培育基中的水分会挥发出来，呵斥培育基中的水假设不将培育皿翻转，培育基