实时荧光定量PCR技术的原理及应用Realtimeppt课件

1、n 实时荧光定量PCR技术的原理及运用n (Real time Quantitative PCR)n 分子生物学技术平台n 江燕琼提纲：提纲：n实时荧光定量PCR原理n 数学原理n 化学原理n实时荧光定量PCR的方法运用n 绝对定量n 相对定量n定量PCR的实验要素n平台定量PCR仪器引见实时荧光定量PCR定义：n 在PCR反响体系中参与荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进展定量分析的方法。与普通PCR的区别n普通PCR技术：n 在PCR终了后对终点产物进展定量分析。n实时定量PCR技术：n实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起n始模板进展定量。n荧光阈值是在荧

2、光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段恣意位置上，普通荧光域值的设置是 基线背景荧光信号的规范偏向的 10 倍。n每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所阅历的循环数被称为 CT 值 threshold value 。 定量PCR的数学原理斜率与扩增效率荧光定量PCR化学原理 非特异性荧光标志： 1、SYBR Green 特异性荧光标志： 2、TaqMan1、SYBR Green 法SYBR Green 熔解曲线分析SYBR Green法优缺陷n优点:n对DNA模板没有选择性n适用于任何DNAn运用方便-不用设计复杂探针n非常灵敏n廉价2、TaqMan探针法TaqMan

3、作用机理作用机理TaqMan法优缺陷n Real-time PCR 方法运用方法运用n绝对定量(Absolute Quantification，AQ)n 病原体检测n 转基因食品检测n 基因表达研讨n相对定量(Relative Quantification，RQ)n 基因在不同组织中的表达差别n 药物疗效考核n 耐药性研讨绝对定量与相对定量的定义绝对定量经过规范品定量n绝对定量的规范样品：n 知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。n规范样品的种类：n含有和待测样品一样扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品一样扩增片段的cDNAnPCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量经过内标定量n内标Endoge

4、nous Control通常是-actin、GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境要素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量相对定量：参照因子Calibrator 相对定量分析方法1 -Ct前提：目的序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在 5以内 1、用内参基因的CT值归一目的基因的CT值： CTtest)= CT target,test) - CT ref,test) CTcalibrator)= CT target, calibrator) - CT ref, calibrator) 2、用校准样本的CT值归一实验样本的CT值： CT= CTtest) - CTcalibrator) 3、计算表达程度比率： 2 CT=表达量的比值相对定量分析方法2：双规范曲线法目的基因与内参基因扩增效率不同n 待测样品目的基因浓度n 待测样品内参基因浓度 n F= n 对照样品目的基因浓度n 对照样品内参基因浓度 定量PCR的实验要素样品nDNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间nDNA用量：0.05 ng 100 ngnRNA纯度：OD260/OD280=2.0 ncDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取1 uL规范品规范品梯度稀释方法n复管测试n样