实验二-----土壤中放线菌的分离

1、实验讲义 5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法取土样时最好选取如 花坛 等地方的土样，去掉表层 510cm 的土壤后取样。放入 100ml 三角瓶中，加入 30ml 水，常压 加热至水沸腾后维持 20min ，取出，置 28-37 摄氏度培养 24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散， 稀释 涂布 于蔗糖豆芽汁 琼脂平皿，置 28-37摄氏度培养 24-48h， 挑取典型 菌落 。实验 6 土壤中放线菌的分离（实训）实验目的： 1 掌握配制合成培养基的一般方法。2 掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3 掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和

2、基本操作技术。4 掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCI、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫 酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。实验原理： 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配 制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO 3 、 NaCI 、 K2HPO4?3H2O 、MgSO4?7H2O 作为无机盐， FeSO4?

3、7H2O 作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、 有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体， 为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯 培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基 或有机氮培养基。如果培养基成分改变， 或土壤预先处理（120C热处理1h）,或加入某种抑制剂（如 加数滴 10%酚等），都可以使细菌， 霉菌出现的数量大大减少， 从而淘汰了其它杂菌。 再通过稀释法， 使

4、放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。实验步骤：1. 高氏一号合成培养基的制备高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）可溶性淀粉 20g,硝酸钾 1g,氯化钠 0.5g , K2HPO4?3H2OO.5g , MgSO47H2O0.5g , FeSO4>7H2O 0.01g，琼脂 20g，水 1000ml, pH7.2 7.4。配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至 1000ml。112C灭菌20分钟。2. 土壤中放线菌的分离（ 1 ）待测样液的制备选定取样点（最好是有机质含量高的菜地） ，按对角交叉（五点法）取样。先

5、除去表层约 2cm 的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 210cm 处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将 5点样品约 1kg 充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置 30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-3、10-4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管23次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每

6、个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌取2支1毫升移液管分别从10-5、10-4菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10-5、10-4的培养皿内。将温度为 4550 C的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合 均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28C左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3 ）涂布平板法分离土壤中放线菌取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50C左右的高氏一号培养基15

7、20ml左右，待冷凝成平板。用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4 ）平板划线法分离土壤中放线菌取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基1012毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡 笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在 火焰旁将

8、培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在 火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿 内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 67条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第 1 次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作 第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°L轩线法2.曲线法3专格法4.放射法5.四格法角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养 基划破。（5）培养接种完毕，将平皿放入 28 C恒温箱培养7天，观察 平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（6）挑菌落待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否

9、已分离到了纯菌 种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4C冰箱中保存。准备实验内容：问曾老师借无菌刮棒打火机酒精灯无菌报纸包（1个） 99mL水/三角瓶（玻璃珠）5支移液管3支9mL水的试管 培养皿6套枪头（1mL/0.1mL ）高氏一号培养基 500mL （150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题： 1检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。2观察与记录以下内容。 大小 形状边缘颜色表面代谢物种类3.如何区分放线菌和真菌、细菌?放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面 为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不 同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可