第九章分子杂交技术1ppt课件

1、探针指的是能与特定的靶分子DNA或RNA发生特异性结合的核酸分子DNA/RNA探针探针主要内容主要内容探针的分类探针的分类探针的标志探针的标志 标志物标志物根据核酸探针的来源及性质可分为：这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁衍，制备方法简便。这类探针多克隆在质粒载体中，无限繁衍，制备方法简便。DNA探针不易降解相对探针不易降解相对RNA而言而言DNA探针的标志方法较成熟探针的标志方法较成熟cDNA探针探针 用这种技术获得的用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。用于基因表达的检测。DNA探针包括探针包括cDNA探针的主要优点有下面

2、三点：探针的主要优点有下面三点： RNARNA探针的主要优点有探针的主要优点有RNA/RNARNA/RNA和和RNA/DNARNA/DNA杂交体的稳定性较杂交体的稳定性较DNA/DNADNA/DNA杂交体的稳杂交体的稳定性高，因此杂交的特异性更高。定性高，因此杂交的特异性更高。单链单链RNARNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高。测核酸顺序杂交的效率较高。RNARNA中不存在高度反复序列，因此非特异性杂交也较少。中不存在高度反复序列，因此非特异性杂交也较少。杂交后可用杂交后可用RnaseRnase将未杂交的游离探针消化

3、掉，从而使本将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。底降低。 由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量由于链短，其序列复杂度低，分子量小，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。靶位点完全杂交的时间比克隆探针短。寡核苷酸探针可识别靶序列内寡核苷酸探针可识别靶序列内1 1个碱基的变化，由于短个碱基的变化，由于短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的TmTm值。值。一次可大量合成寡核苷酸探针一次可大量合成寡核苷酸探针1 110mg10mg，使得这，使得这种探针价钱低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针可以种探针价钱低廉，与克隆探针一样，寡核苷酸探针可以

4、用酶学或化学方法修饰以进展非放射性标志物的标志。用酶学或化学方法修饰以进展非放射性标志物的标志。切口平移法切口平移法该技术由该技术由KellyKelly等于等于19701970年创建。年创建。其原理是首先用其原理是首先用DNADNA酶在双链酶在双链DNADNA探针分子的一条链探针分子的一条链上制造一些切口上制造一些切口nick nick , ,切口处会构成切口处会构成3 3羟基羟基末端，这时再在大肠杆菌末端，这时再在大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的催化下将核的催化下将核苷酸残基加在苷酸残基加在3 3羟基上，同时，根据大肠杆菌酶羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNADNA聚合酶聚合酶I I的

5、的5 533核酸外切酶活性，此酶将缺口核酸外切酶活性，此酶将缺口5 5侧核苷酸依次切除。侧核苷酸依次切除。其结果是在切口平移。其结果是在切口平移。用切口平移法标志的用切口平移法标志的DNADNA探针能满足大多数杂交要探针能满足大多数杂交要求。求。 随机引物延伸随机引物延伸random primer)random primer)这是以单链这是以单链DNADNA或或RNARNA模板合成高比活性模板合成高比活性32P32P标志探标志探针所选用的方法。针所选用的方法。原理是使长原理是使长6 68nt8nt的寡核苷酸片段与变性的的寡核苷酸片段与变性的DNADNA或或RNARNA模板退火，在模板退火，在D

6、NADNA聚合酶聚合酶I I或反转录酶的作用下，或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNADNA链的合成，在反响时将链的合成，在反响时将-32PdNTP-32PdNTP掺入合成掺入合成链，即得到标志。变性处置后，新合成链探针片链，即得到标志。变性处置后，新合成链探针片段与模板解离，即得到无数各种大小的探针段与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNADNA。由于所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模由于所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板板DNADNA随机发生退火反响，因此被称为随机引物随机发生退火反响，因此被称为随

7、机引物random primerrandom primer。这种随机引物可用小牛胸腺这种随机引物可用小牛胸腺DNADNA或鱼精或鱼精DNADNA制备。制备。聚合酶链反响聚合酶链反响PCRPCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标志高比活性志高比活性DNADNA探针。探针。PCRPCR技术具有很高的特异性，可在技术具有很高的特异性，可在1 12h2h之内大量之内大量合成探针合成探针DNADNA片段，假设在底物中参与片段，假设在底物中参与-32PdNTP32PdNTP或其它标志的或其它标志的dNTPdNTP，那么探针，那么探针DNADNA合成过合成过程中

8、可得到很好的标志，标志物的掺入率可高达程中可得到很好的标志，标志物的掺入率可高达70%70%80%80%。因此，因此，PCRPCR标志技术特别适用于大规模检测和非放标志技术特别适用于大规模检测和非放射性标志。射性标志。该法的缺陷是要合成一对特异性该法的缺陷是要合成一对特异性PCRPCR引物。引物。运用从探针运用从探针DNADNA上制备的小片段作引物也能获得较上制备的小片段作引物也能获得较好的标志效果。好的标志效果。l2过强的放射线可以呵斥核酸分子构造过强的放射线可以呵斥核酸分子构造的破坏。的破坏。l3半衰期短，标志后立刻便用半衰期短，标志后立刻便用32P/14.3d 35S/87.1d 3H/

9、12.1y 。常用的放射性同位素有：常用的放射性同位素有：132P放射性强，穿透性较强，因此自显影所放射性强，穿透性较强，因此自显影所需时间短，灵敏度高。广泛运用于各种滤膜杂交需时间短，灵敏度高。广泛运用于各种滤膜杂交和液相杂交。和液相杂交。 射线散射严重，分辨率不高射线散射严重，分辨率不高235S 可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但可以取代磷酸分子上的一个氧原子，但分辨率高可用于核酸序列测定及细胞原位杂分辨率高可用于核酸序列测定及细胞原位杂交。半衰期较长。交。半衰期较长。 灵敏度较灵敏度较P低低33H 散射极少，半衰期长散射极少，半衰期长 自显影时间较长自显影时间较长4125I 、131I

10、散射小，分辨率高，显影时间散射小，分辨率高，显影时间比比H短很多。短很多。 具有挥发性，吸入后蓄积具有挥发性，吸入后蓄积非放射性标志物有下述几类： 金属如Hg，荧光物质如FITC； 半抗原如地高辛； 生物素； 酶类如辣根过氧化物酶HRP； 半乳糖苷酶或碱性磷酸酶AP等。 非放射性同位素 无放射性、稳定性好 灵敏度及特异性不高图20-4生物素标志核酸探针荧光免疫反响图解图图 生物素标志核酸探针荧光免疫反响图解生物素标志核酸探针荧光免疫反响图解 在选择标志方法时，应思索实验的要求在选择标志方法时，应思索实验的要求 普通以为放射性探针比非放射性探普通以为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷

11、贝基因序列针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标志效率高、显示灵敏的探时，应选用标志效率高、显示灵敏的探针标志方法。在对灵敏要求不高时，可针标志方法。在对灵敏要求不高时，可采用保管时间长的生物素探针技术和比采用保管时间长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。较稳定的碱性磷酸酶显示系统。固相支持物应具备的特点：固相支持物应具备的特点：1) 具有较强的结合核酸分子的才干具有较强的结合核酸分子的才干10 g/ cm2 2) 与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反响。与核酸结合后，不影响其与探针分子的杂交反响。3) 与核酸稳定结实结合，能经受杂交、洗膜等操作与核酸稳定结实结合，能经

12、受杂交、洗膜等操作 过程。过程。4) 非特异性吸附少。非特异性吸附少。5) 具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。具有良好的机械性能，如柔软性，柔韧性。1、固相杂交支持物的选择几种常用固相支持物几种常用固相支持物1)硝酸纤维素虑膜硝酸纤维素虑膜nitrocellulose filter membrane 具有较强吸附单链具有较强吸附单链DNA和和RNA的才干高盐下达的才干高盐下达 80 g/ cm2 100 g/ cm2 。真空烘干后，依托疏水性相互作用。真空烘干后，依托疏水性相互作用。杂交本底较低。杂交本底较低。不易反复杂交和洗膜结合力不易反复杂交和洗膜结合力质地较脆，烘烤后更甚，小心操作质

13、地较脆，烘烤后更甚，小心操作与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳，与核酸结合依赖高盐，低盐结合不佳， 不易核酸电转不易核酸电转2) 尼龙膜尼龙膜nylon membrane 结合单链结合单链DNA和和RNA的才干比的才干比NC膜强达膜强达 350 g/ cm2 500 g/ cm2 。真空烘干后或紫外线照射可强化结合短波真空烘干后或紫外线照射可强化结合短波UV照射后照射后, 部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加结实。部分嘧啶碱基与其氨基交联，更加结实。微波处置和碱处置也可促结合，从而使细菌裂解、微波处置和碱处置也可促结合，从而使细菌裂解、DNA 变性与固定一步完成菌落原位杂交。变性与固定一步完成菌落原位

14、杂交。 韧性较强，操作方便。韧性较强，操作方便。 能结合小分子核酸。能结合小分子核酸。 低盐也能很好结合可用于核酸电转移。低盐也能很好结合可用于核酸电转移。 可反复杂交和洗膜。可反复杂交和洗膜。杂交本底较高杂交本底较高3、固相核酸分子杂交类型斑点杂交斑点杂交Dot blot 斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。斑点杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪售有多种多管吸印仪manifolds，如，如Minifold

15、I和和II、Bio-Dot (Bio Rad )和和Hybri Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进展杂交。这时的膜就可以进展杂交。 u组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。杂交，它与菌落的原位杂交不同。u原位杂交是经适当处置后，使细胞通透性添加，让原位杂交是经适当处置后，使细胞通透性添加，让探针进入细胞内与探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交。因此杂交。因此, ,原位杂交可原位杂交可以确定探针的互补序列在