第1节克隆操作中使用的工具酶1ppt课件

1、基因工程操作中最常用的工具酶基因工程操作中最常用的工具酶1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 DNA2 DNA衔接酶衔接酶3 DNA3 DNA聚合酶聚合酶4 4 修修 饰饰 酶酶5 5 小小 结结SUMMARYHomeHome核酸酶核酸酶Nuclease： 经过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，经过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。1按作用对象分按作用对象分: DNAase & RNAase2按断裂核酸分子不同方式分：按断裂核酸分子不同方式分： Endonuclease & Exonucl

2、ease限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶restriction endonuclease):restriction endonuclease): 指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸序列，分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链并在识别序列内或附近特异切割双链DNADNA的核酸内的核酸内切酶。切酶。 限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制- -修修饰系统饰系统Restriction-Modification Restriction-Modification System)System)。Back命名原那么：命名原那么：第一个字

3、母大写第一个字母大写, 斜体：斜体： 该酶来源的微生物属名；该酶来源的微生物属名；第二、三个字母小写、斜体：微生物种名；第二、三个字母小写、斜体：微生物种名；假设该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个假设该微生物有不同的变种和品系，再加上该变种和品系的第一个字母大写字母大写假设从同一微生物发现多种限制性内切酶，那么按照发现和分别的假设从同一微生物发现多种限制性内切酶，那么按照发现和分别的先后顺序用罗马字母表示。先后顺序用罗马字母表示。例如：例如：EcoR 从大肠杆菌从大肠杆菌R株分别的第一种限制酶命名为株分别的第一种限制酶命名为EcoR， 其中其中E 代表属名代表属名Esche

4、richia)，co 代表种名代表种名coli)，R 代表株系代表株系RY13， 代表该菌株中初次分别到。代表该菌株中初次分别到。Back1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶Back功能：限制、修饰功能：限制、修饰特点：需特点：需Mg2+Mg2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸为辅腺苷蛋氨酸为辅助因子；识别位点和切割位点不一助因子；识别位点和切割位点不一致，无固定切割位点；致，无固定切割位点；运用：不常用。运用：不常用。Back功能：限制、修饰功能：限制、修饰特点：需特点：需Mg2+Mg2+、ATPATP和

5、和S-S-腺苷蛋氨酸为辅助因腺苷蛋氨酸为辅助因子；特异切割，切割位点在距识别位子；特异切割，切割位点在距识别位点点33端端24-26 bp24-26 bp处。处。运用：数量很少，无实践作用。运用：数量很少，无实践作用。Back功能：识别并特异切割功能：识别并特异切割DNADNA分子。分子。 即通常所指即通常所指DNADNA限制性核酸内切酶；限制性核酸内切酶；反响特点：仅需反响特点：仅需 Mg2+ Mg2+ 作催化反响辅助因子，作催化反响辅助因子，能识别双链能识别双链DNADNA特殊序列，并可特异切割特殊序列，并可特异切割DNADNA，产生特异片段；，产生特异片段；运用：种类繁多，分子克隆中最为

6、常用运用：种类繁多，分子克隆中最为常用 识别长度为识别长度为4-84-8个核苷酸的特异序列；个核苷酸的特异序列； 许多识别序列具回文构造，如许多识别序列具回文构造，如Hind Hind 的的识别序列：识别序列： 5 AAGCTT 3 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCGAA 5 切割产生末端有粘端切割产生末端有粘端 (cohesive/sticky (cohesive/sticky end) end) 如如BamH I (GGATCC) BamH I (GGATCC) 和平端和平端 (blunt end) (blunt end) 如如Sma I (CCC GGG)Sma I

7、 (CCC GGG)Recognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 来源不同但能识别和切割同一位点的酶。来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。又称同裂酶。 如：如：BamH I (GGATCC)和和Bst I (G GATCC) 注：有一些同功异源酶对于切割位点上的注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。甲基化碱基的敏感度有所不同。 识别序列不同，但产生一样粘性末端的限制酶。识别序列不同，但产生一样粘性末端的限制酶。 如：如：BamH I : GGATCC Bgl II

8、: AGATCTBack(1) 活性大小：酶对活性大小：酶对DNA水解程度不同。水解程度不同。(2) 酶的活性单位：酶的活性单位： 指指1g 纯的指定纯的指定DNA在指定缓冲液中，于在指定缓冲液中，于37最适温度更准确酶解最适温度更准确酶解1 h完全酶解完全酶解DNA中一切同一限制性内切酶位点所需的中一切同一限制性内切酶位点所需的酶量。酶量。 DNA模板的纯度模板的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反响温度酶切反响温度 DNA的分子构造的分子构造 缓冲液缓冲液Back2.1 定义及功能定义及功能2.2 种类及作用机理种类及作用机理2.3 运用时的本卷须知运用时的本卷须知Home DNA

9、 DNA衔接酶衔接酶DNA ligaseDNA ligase： 可使一段可使一段DNA 3-OHDNA 3-OH末端和末端和5-P 5-P 末端末端构成构成3,5-3,5-磷酸二酯键，把两磷酸二酯键，把两DNADNA片段片段连在一同封锁双链上构成的切口的酶。连在一同封锁双链上构成的切口的酶。OH P53355335DNA ligaseDNA ligase DNA ligase 衔接缺刻衔接缺刻(nick)(nick)Back 两类两类: T4 DNA衔接酶衔接酶(ATP提供能量提供能量 大肠杆菌大肠杆菌DNA衔接酶衔接酶NAD+提供能量提供能量2.2 种类及作用机理种类及作用机理T4 DNA

10、ligase 的作用机理的作用机理Back1)1)不能催化两单链不能催化两单链DNADNA分子衔接；分子衔接；2)2)只能连双链只能连双链DNADNA分子的单链缺刻分子的单链缺刻(nick)(nick)；不；不能衔接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺能衔接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口口(gap)(gap)。2.3 运用时的本卷须知运用时的本卷须知DNA ligase 的活性的活性Back3.1 DNA聚合酶聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶3.4 逆转录酶逆转录酶3.5 T4 DNA聚合酶聚合酶3.6 T7 DNA聚合酶聚合酶Home活性：活性：5

11、353聚合活性，聚合活性，5353外切和外切和35 35 外切活性。外切活性。发扬生物学活性的条件：发扬生物学活性的条件：1 1DNADNA模板可以是单链或双链模板可以是单链或双链2 2带有带有3-3-端游离羟基的引物链端游离羟基的引物链3 3底物和激活剂底物和激活剂注：对双链注：对双链DNADNA，当有，当有dNTPdNTP存在时，存在时， 35 35降解活降解活性会被性会被5353方向的聚合活性所抑制。方向的聚合活性所抑制。运用：缺口平移法制备运用：缺口平移法制备DNADNA分子杂交探针分子杂交探针缺口缺口DNase IDNA聚合酶聚合酶 IDNA聚合酶聚合酶 IdNTP*缺口缺口缺口平移

12、法制备缺口平移法制备DNADNA分子探针分子探针Back活性：活性： 53聚合活性，聚合活性，35 外切酶活性，无外切酶活性，无53 外切酶活性。外切酶活性。用途：用途： 1填补或标志填补或标志DNA的的3隐蔽末端；隐蔽末端； 2催化合成催化合成cDNA第二链；第二链； 3DNA序列测定序列测定EcoR I 酶切末端酶切末端同位素标志的同位素标志的EcoR I 酶切末端酶切末端- 32P-dATPBack显著特点：热稳定性。显著特点：热稳定性。7070反响反响2h2h残留活性残留活性90 %90 %； 93 93 反响反响 2 h 2 h残留活性残留活性60% 60% ；94 94 反响反响

13、2 h 2 h残留活性残留活性40%40%。运用：运用：1 1对对DNADNA的特定片段进展体外扩增；的特定片段进展体外扩增； 2 2 DNA DNA序列测定。序列测定。Back逆转录酶逆转录酶 (reverse transcriptase)： 又称又称RNA指点下的指点下的DNA聚合酶。聚合酶。活性：活性： 53聚合酶活性和聚合酶活性和RNaseH活性。聚协活性。聚协作用所需模板可以是作用所需模板可以是RNA或或DNA，引物是带，引物是带3-OH的的RNA或或DNA。逆转录酶的活性逆转录酶的活性 用途：用途：1在体外以在体外以mRNA为模板合成为模板合成cDNA；2对有对有5突出末端的突出末

14、端的DNA片段作末端标片段作末端标志补平；志补平；3双脱氧法测序；双脱氧法测序；4以以DNA或或RNA为模板合成核酸探针。为模板合成核酸探针。Back活性：活性： 53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性，且性，且35外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNA的作的作用比对双链用比对双链DNA强。强。 高浓度高浓度dNTP 环竟下前者活性更强。环竟下前者活性更强。运用：标志运用：标志DNA平末端或隐蔽平末端或隐蔽3末端末端Back活性：活性：53聚合酶活性；有单链及双链的聚合酶活性；有单链及双链的35外切酶活性，但无外切酶活性，但无53外切酶活性；外切酶活性；特点：极佳的延续合成才干特点

15、：极佳的延续合成才干运用：运用：1用于长模板用于长模板DNA的引物延伸反响；的引物延伸反响；2经过单纯延伸或取代合成途径标志经过单纯延伸或取代合成途径标志DNA 3末末端；端；3使双链使双链DNA 5或或3突出末端变平末端。突出末端变平末端。Back4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶4.2 末端转移酶末端转移酶4.3 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4 S1核酸酶核酸酶 Home功能：催化核酸脱功能：催化核酸脱5-磷酸基团，使磷酸基团，使DNA或或RNA片段片段5-P末端转换成末端转换成5-OH末端。末端。来源：来源：大肠杆菌：大肠杆菌： bacterial alkaline phosphatase

16、 (BAP); 小牛肠道小牛肠道: calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶的活性 留意：留意：CIPCIP的比活性比的比活性比BAPBAP高出高出10-10-2020倍，且倍，且CIPCIP在在SDSSDS中中6868就可完全就可完全失活，而失活，而BAPBAP却是热抗性酶。却是热抗性酶。Back来源来源: 前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。功能：催化功能：催化DNA进展进展53方向的聚协作用方向的聚协作用, 逐个逐个将将dNTP分子加到线性分子加到线性DNA分子分子3-OH端。端。末端

17、转移酶的催化作用末端转移酶的催化作用 用途：用途：(1) (1) (主要主要) )给外源给外源DNADNA片段和及载体加互片段和及载体加互补同聚物尾巴；补同聚物尾巴；(2) (2) 标志标志DNADNA片段的片段的33末端。末端。Back 来源来源: T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 功能：催化功能：催化-磷酸从磷酸从ATP分子转移给分子转移给DNA或或RNA的的5-OH末端图。末端图。T4 多核苷酸激酶的活性正向反响多核苷酸激酶的活性正向反响DNA/RNADNA/RNA单链或双链单链或双链T4T4多核苷酸激酶的交换活性多核苷酸激酶的交换活性过量过量 用途：用途：1标志标志DNA的的5-末端；末端；2使缺失使缺失5-P末端的末端的DNA发生发生磷酸化作用。磷酸化作用。Back来源：来源于稻谷曲霉来源：来源于稻谷曲霉Aspergillus Aspe