资料]分子生物学研究方法总复习(刘剑老师)课件

1、资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 分子生物学研究方法分子生物学研究方法 刘剑刘剑 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )2.限制性核酸内切酶的命名原则限制性核酸内切酶的命名原则1973年，年，1980年进行了系统分类年进行了系统分类限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜限制性核酸内切酶第一个字母（大写，斜体）代表该酶的宿主菌属名体）代表该酶的宿主菌属名;第二、三个字母第二、三个字母(小写，斜体小写，斜体)代表宿主菌种名。代表宿主菌种名。第四个字母代表宿主菌的株系或型。第四个字母代表宿主菌的株系或

2、型。若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。字母表示。资料资料分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习(刘剑老师刘剑老师)l限制性核酸内切酶的命名原则：l属名 种名 株名lHaemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌d株 l Hind Hindl同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 4.型限制性核酸内切酶的功能型限制性核酸内切酶的功能型限制性核酸内切酶有严格的识

3、别、型限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，识别序列一般为切割顺序，识别序列一般为48个碱基对个碱基对，具有回文结构。它以核酸内切方式水解，具有回文结构。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段片段5端为端为P，3端为端为OH。限制性核酸内切限制性核酸内切酶切割双链酶切割双链DNA产生产生3种不同的切口。种不同的切口。 EcoR的识别序列的识别序列5- GAATTC-33- CTTAAG 5资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘

4、剑老师) )资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ).限制性核酸内切酶的星活性限制性核酸内切酶的星活性指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同指由于反应条件改变，酶切的核酸序列不同于它特定于它特定的识别序列的识别序列,即酶切反应的特异性发生了改变即酶切反应的特异性发生了改变。资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )5.2.2 5.2.2 DNADNA分子的连接分子的连接（运用（运用DNADNA连接酶进行连接连接酶进行连接

5、）DNA连接酶能催化双链连接酶能催化双链DNA切口处的切口处的5-磷酸根和磷酸根和3-羟基生成磷酸二酯键。这种羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要能量。大肠杆菌和其他细菌的反应需要能量。大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以连接酶以NAD+作为能量来源，动作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为作为能量来源。能量来源。资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的另一种细菌菌株的DNA而导致遗传性状特征发生而导致遗传性状特征发生

6、改变的生命过程。提供转化改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体的菌株叫作供体菌株，接受转化菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌的细菌菌株则被称为受体菌株。株。 处于能够接受外源处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态状态的细胞称为感受态细胞。细胞。5.2.3 细菌转化细菌转化资料资料分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习(刘剑老师刘剑老师)5.2.3 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖（自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA片

7、段的凝胶电泳技片段的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。互作用的重要实验手段，也是现在通用的分子生物学研究方法。 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 在一般情况下，核酸分子之糖在一般情况下，核酸分子之糖-磷酸骨架中磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，DNA和和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子多核苷酸链又被称为多聚阴离子，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就，

8、把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。会向正电极的方向迁移。大分子量的大分子量的DNA移动的慢移动的慢小分子量的小分子量的DNA移动的快移动的快电泳缓冲液电泳缓冲液阳极阳极阴极阴极DNA加样孔加样孔资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )2.4. PCR(2.4. PCR(聚合酶链式反应聚合酶链式反应) )及其及其应用应用概念：在引物指导下由酶催化的概念：在引物指导下由酶催化的对特定对特定DNADNA序列进序列进 行的体外扩增反应。由多个行的体外扩增反应。由多个循环组成。每个循环包括了变性循环组成。每个循环包括了变性、退火以及延

9、伸三个阶段。、退火以及延伸三个阶段。资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列靶序列靶序列资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )PCR 循环循环- 第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )PCR 循环循环 - 第三步第三步 - 引物延伸引物延伸靶序列靶序列靶序

10、列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerase资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )第第1个个 PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列BiotinBiotin资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )引物长度：引物长度：15-30个碱基，常为个碱基，常为20个碱基左右个碱基左右引物扩增跨度：以引物扩增跨度：以500 bp为宜，特定条件下可扩增长至为宜，特定条件下可扩增长至10kb

11、的片段的片段引物碱基：引物碱基： ATGC最好随机分布最好随机分布避免引物内部及引物间出现二级结构：特别是避免引物内部及引物间出现二级结构：特别是 3端端引物引物 3端的碱基要求严格配对：特别是最末及倒数第端的碱基要求严格配对：特别是最末及倒数第二个碱基二个碱基引物中可以加上合适的酶切位点：要作酶切时用引物中可以加上合适的酶切位点：要作酶切时用引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性显同源性三、引物设计原则三、引物设计原则资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )标准的PCR反应体系

12、4 4种种dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2 2.5u5uMgMg2+ 2+ 1 1.5mmol/L5mmol/L四、四、PCR反应体系反应体系资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )5.3 5.3 基因克隆技术基因克隆技术基因克隆（分子克隆基因克隆（分子克隆molecular cloning）-通过体外重组技通过体外重组技术术,将一段目的将一段目的DNA经切割、连接插入

13、适当载体经切割、连接插入适当载体,并导入受体并导入受体细胞，细胞， 进行进行DNA分子扩增、筛选、鉴定等的过程。分子扩增、筛选、鉴定等的过程。资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )具体流程具体流程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )（一）目的基因（一）目的基因的获取的获取1.

14、 化学合成法化学合成法2.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)或或RT-PCR4. 分离克隆差别表达的基因分离克隆差别表达的基因 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 分子克隆载体是一类可供外源分子克隆载体是一类可供外源DNA插入并携带重组插入并携带重组DNA分分子进入适当宿主细胞的子进入适当宿主细胞的DNA分子。分子。将重点讲述将重点讲述分子克隆载体的特点分子克隆载体的特点; 常见分子克隆载体常见分子克隆载体; 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方

15、法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )分子克隆载体总述分子克隆载体总述、载体的功能、载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制扩增能力为外源基因提供复制扩增能力资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )、载体特点、载体特点至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2. 至少应有一个克隆位点，以供外源至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。插入。3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是

16、否分子是否进入宿主细胞进入宿主细胞资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记Amppolylinker基因载体基因载体资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )5.4 5.4 核酸杂交技术核酸杂交技术（一）（一）Southern Blot（二）（二）Northern Blot（三）斑点杂交（三）斑点杂交 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )5.4 5.4 核酸杂交技术核酸杂交技术（一）（一）Sou

17、thern Blot原理：原理：将待检测的将待检测的DNA分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝分子经限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的记物标记的DNA或或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显离

18、探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。示出待检的片段及其相对大小。用途：检测用途：检测DNA样品中的基因及其含量等。样品中的基因及其含量等。 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) Southern Blot 操作步骤：操作步骤：DNA 琼脂糖电泳琼脂糖电泳 印迹转移印迹转移 杂交（变性探针）杂交（变性探针） 洗膜洗膜 放射自显影或显色放射自显影或显色资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )原理：在变性条件下将待检的原理：在变性条件下将待检的RNA样品进样品进行

19、琼脂糖凝胶电泳，继而按照同行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。交检测。用途：检测用途：检测RNA样品中是否含有基因的转样品中是否含有基因的转录产物（录产物（mRNA）及其含量。）及其含量。 （二）（二）Northern Blot Northern Blot 资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )操作过程操作过程 mRNA提取提取 甲醛变性电泳甲醛变性电泳 印迹转移印迹转移 杂交（变性探针）杂交（变性探针） 洗膜洗膜 放射自显影或化学发光放射自显影或化学发光资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) ) 斑点杂交：斑点杂交：将将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄产物点在硝酸纤维素膜或尼龙膜薄膜上膜上寡核苷酸探针杂交寡核苷酸探针杂交观察有无着色斑点观察有无着色斑点主要用于主要用于 PCR产物特异性鉴定等。产物特异性鉴定等。资料资料 分子生物学研究方法总复习分子生物学研究方法总复习( (刘剑老师刘剑老师) )何谓何谓SNP(单核甘酸多态