第五章第三节——四层析1ppt课件

1、四、层析四、层析 （一）、层析的由来与发展（一）、层析的由来与发展 1901年，俄国植物学家茨维特将植物色素提年，俄国植物学家茨维特将植物色素提取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以取液加到装有碳酸钙微粒的玻璃柱子上部，继而以石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中得到分石油醚淋洗柱子，结果使不同的色素在柱中得到分离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微离而形成不同颜色的谱带。混合色素通过碳酸钙微粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜粒被分离成不同色带的现象，像一束光线通过棱镜时被分离成不同色带的光谱现象一样。时被分离成不同色带的光谱现象一样。 1906年在一篇论文中将这种方法正

2、式命名为色年在一篇论文中将这种方法正式命名为色谱法，色谱法由此得名。谱法，色谱法由此得名。 1931Kuhn, Lederer1931Kuhn, Lederer用氧化铝和碳酸钙分离用氧化铝和碳酸钙分离-、-和和-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。 1938Izmailov, Shraiber1938Izmailov, Shraiber最先使用薄层色谱法。最先使用薄层色谱法。 1938Taylor, Uray1938Taylor, Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。素。 1941Martin, Synge1941

3、Martin, Synge提出色谱塔板理论；发明液提出色谱塔板理论；发明液- -液分配色液分配色谱；预言了气体可作为流动相即气相色谱）。谱；预言了气体可作为流动相即气相色谱）。 1944Consden1944Consden等发明了纸色谱。等发明了纸色谱。 1949Macllean1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。 1952Martin, James1952Martin, James从理论和实践方面完善从理论和实践方面完善了气了气- -液分配色谱法。液分配色谱法。 1956Van Deemt

4、er1956Van Deemter等提出色谱速率理论，并等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。应用于气相色谱。 19571957 基于离子交换色谱的氨基酸分析专用基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。仪器问世。 1958Golay1958Golay发明毛细管柱气相色谱。发明毛细管柱气相色谱。 1、原理 色谱法色谱法(Chromatography），也称色层），也称色层法或层析法法或层析法(后文中我们称之为层析法）。此后文中我们称之为层析法）。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学子大小与形状、吸附力、亲和力等物理

5、化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。续多次分配，从而彼此分离。 层析不只是分离技术，也是一种分析方法。层析不只是分离技术，也是一种分析方法。层析分离法基本原理层析分离法基本原理9在色谱操作中，加入洗脱剂而使各在色谱操作中，加入洗脱剂而使各组 分 分 层 的 操 作 称 为 展 开组 分 分 层 的 操 作 称 为 展 开Development），），洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液液Eluate），），而展开后各组分的分

6、布情况称为色而展开后各组分的分布情况称为色谱谱Chromatography）。）。2、层析方法的共同特点： 层析分离体系都有流动相和固定相两个层析分离体系都有流动相和固定相两个相。相。 层析过程中，流动相对固定相作连续的层析过程中，流动相对固定相作连续的相对运动。相对运动。 被分离样品在两相中具有不同的作用力，被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。定相，实现分离。层析分离方法层析分离方法 层析方法层析方法分离依据分离依据吸附层析吸附层析利用吸附剂对不同物质的利用吸附剂对不同物质的吸附力吸附力不同而使混不同而使混合

7、物中各组分分离合物中各组分分离分配层析分配层析利用各组分在两相中的利用各组分在两相中的分配系数分配系数不同，而使不同，而使各组分分离各组分分离离子交换层离子交换层析析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的对各种离子的亲和力亲和力不同而达到分离目的不同而达到分离目的凝胶层析凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的含各种组分的相对分子质量相对分子质量不同而达到物质不同而达到物质分离分离亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的利用生物分子与配基之间所具有的专一而又专一而又可逆的亲和力可

8、逆的亲和力，使生物分子分离纯化，使生物分子分离纯化层析聚焦层析聚焦将酶等两性物质的将酶等两性物质的等电点特性等电点特性与离子交换层与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离析的特性结合在一起，实现组分分离1. 1. 固定相：层析基质固定相：层析基质2. 2. 流动相：洗脱剂流动相：洗脱剂( (柱层析）、柱层析）、 展层剂薄层层析）展层剂薄层层析）3.3.操作容量：在特定条件下，某操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的般以每克基质结合某种成分的mmolmmol数或数或mgm

9、g数表示。数表示。固定相流动相（二常用术语（二常用术语4. 4. 床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积积VtVt）。）。5. 5. 洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。6. 6. 膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积体积VV）。）。7. 7. 分配系数和迁移率分配系数和迁移率K 在固定相中的含量在固定相中的含量在流动相中的含量在流动相中的含量Rf 在固定相中移动的距离在固定相中移动的距

10、离在流动相中移动的距离在流动相中移动的距离外水体积外水体积 Vo Vo洗脱体积洗脱体积 Ve Ve固定相固定相层析床层析床床体积外水体积床体积外水体积基质体积内水体积基质体积内水体积 Vt Vo Vg Vi（三）、吸附柱层析（三）、吸附柱层析 吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的层析方法。 在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。经过一段时间以附，再解吸、再吸附的过程。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物短与吸附剂对该物质的

11、吸附力以及溶剂对该物质的解吸质的解吸( (溶解溶解) )能力有关。能力有关。1、洗脱原理、洗脱原理吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。 2、 吸附剂的选择吸附剂的选择 吸附剂：将其它物质聚集到自己表面的物质。吸附剂：将其它物质聚集到自己表面的物质。 被吸附物：能聚集于吸附剂表面的物质。被吸附物：能聚集于吸附剂表面的物质。 在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本在选择具体吸附剂时，主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说，身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说， 极性吸附剂易吸附极性物质，非极性的吸附剂易极性吸附剂易吸附极性物质，非极性的吸附剂易吸附非极

12、性的物质。但是为了便于解吸附，对于吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。亦然。（1羟基磷灰石羟基磷灰石 羟基磷灰石羟基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，简称，简称HA的吸附容量的吸附容量高，稳定性好高，稳定性好(在在T85，pH5.5-10.0均可使用均可使用)，因，因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如物质方面得到了广泛的应用。有时有些样品如RNA、双链双链DNA、单链、单链DNA和杂合型双链和杂合型双链D

13、NA-RNA等，经等，经过一次过一次HA柱层析，就能达到有效的分离。柱层析，就能达到有效的分离。 HA的的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相基团和生物分子表面的负电荷基团的相互作用，在用互作用，在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。分离生物分子过程中起着重要作用。而而HA的的PO43-基团与生物分子表面的正电荷基团的相基团与生物分子表面的正电荷基团的相互作用，则仅起着次要的作用。互作用，则仅起着次要的作用。 使用使用HA作为固定相基质的注意事项：作为固定相基质的注意事项： (1) HA系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度系干粉时，要先在蒸馏水中浸泡，使其膨胀度(水水化后所占有的体

14、积化后所占有的体积)达到达到2-3mL/克后，再按克后，再按1 6体积加入缓体积加入缓冲液悬浮，以除去细小颗粒；冲液悬浮，以除去细小颗粒； (2) HA悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅悬浮液须用旋涡振荡器混合，若用磁棒或玻棒搅拌时，拌时，HA的晶体结构会被破坏；的晶体结构会被破坏； (3) 忌用柠檬酸缓冲液和忌用柠檬酸缓冲液和pH5.5的缓冲液。的缓冲液。 (4) 就操作容量来说，一般细颗粒就操作容量来说，一般细颗粒HA比粗的大。而从分比粗的大。而从分辨率比较，粗颗粒辨率比较，粗颗粒HA也没有细的好。也没有细的好。（2硅胶硅胶 是最常用的吸附剂，通常用是最常用的吸附剂，通常用SiO2

15、.xH2O表示，是具有硅表示，是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。吸附力。 水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性，经加热可被除去的水称自由水，若自由水含量达除去的水称自由水，若自由水含量达17%以上，则吸附力以上，则吸附力极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在极低，此时，硅胶只能用于分配层析。若将硅胶在105-110加热加热30min ，吸附能力显著增强，这一过程

16、称为活化。，吸附能力显著增强，这一过程称为活化。如果将硅胶加热到如果将硅胶加热到500，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，硅醇基结构会变成硅氧烷结构，吸附能力显著下降。吸附能力显著下降。 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。酸、氨基酸、甾体等。 柱层析硅胶柱层析硅胶变色硅胶也称蓝胶变色硅胶也称蓝胶是以具有高活性吸附是以具有高活性吸附材料细孔硅胶为基础材料细孔硅胶为基础原料经过深加工制成原料经过深加工制成的的 细孔硅胶为无色或微黄色透明状玻璃体，它的基本质量参数如下：平均孔距2.0-3.0MM （3氧化铝氧化铝 分酸性、碱

17、性和中性三种，酸性氧化铝分酸性、碱性和中性三种，酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝适合于分离酸性化合物，碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，中性氧化适合于分离碱性化合物，中性氧化铝铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。合物。 氧化铝用前也需脱水活化，通常于氧化铝用前也需脱水活化，通常于400高温下加热高温下加热6h，使氧化铝的含水量在，使氧化铝的含水量在0%-3%之间，之间， 可得到可得到级或级或级氧化铝，但温度过级氧化铝，但温度过高也会破坏氧化

18、铝的内部结构。高也会破坏氧化铝的内部结构。4.大孔吸附树脂和聚酰胺大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。近年用于中药活性成分的分离。 活性氧化铝活性氧化铝 氧化铝空心球 氧化铝粉高温氧化铝高温氧化铝氧化氧化鋁絲鋁絲 3、洗脱剂的选择 洗脱剂指的是能够驱使固定相中的有效成分洗脱剂指的是能够驱使固定相中的有效成分和部分杂质沿一定方向有规律移动，并能够使有和部分杂质沿一定方向有规律移动，并能够使有效成分与其他组成物分开的缓冲液。通常它们也效成分与其他组成物分开的缓冲液。通常它们也是溶解被吸附样品和平衡固定相的缓冲液。合适是溶解被吸附样品和平衡固定相的缓冲液。合适的洗脱剂应符合下列条件：的洗

19、脱剂应符合下列条件： 纯度较高；纯度较高； 稳定性好；稳定性好； 能较完全洗脱所分离的成分；能较完全洗脱所分离的成分； 黏度小；黏度小； 易和所需要的成分分开。易和所需要的成分分开。 4、 操作操作 柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测磁力搅拌器和恒流泵。有条件时，配置一台检测仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。仪和一台记录仪就构成一个完整的层析系统。 （1层析柱层析柱 层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。层析柱是下端有细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为柱的直径与长度之比，一般为1 10- 1

20、40。采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析采用极细吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。（2吸附剂的用量吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时，物中各成分的性质决定的。当操作容量高时， 吸吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中

21、各成分的性质相似难以分开时，倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于样品的则吸附剂用量应增大，有时大于样品的100倍倍 （3装柱装柱 装柱的方法分干装法和湿装法两种。湿装法装柱的方法分干装法和湿装法两种。湿装法系先加适量平衡液到柱内，排走其中的空气，系先加适量平衡液到柱内，排走其中的空气，然后把预先用平衡液浸泡好的吸附剂搅匀，然后把预先用平衡液浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉随即将此悬浮液连续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口，让溶剂慢时打开柱下端口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的慢流出，使

22、柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。高度。 这种装柱法对各种基质都适用。层析柱中这种装柱法对各种基质都适用。层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的标准。的标准。 （4 4上样和洗脱上样和洗脱 上样：用滴管轻轻地把样品溶液加到固定上样：用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的液的体积一般应小于床体积的1/21/2。洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗用滴管加入洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同