药品微生物限度检查方法验证步骤及示教

1、药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目 样品要求：不含菌或少量菌 验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。 2. 确定供试液制备方法 3. 方法选择预试验 （1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。 （3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法 控制菌验证方法4. 验证试验：

2、选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。6. 写出验证资料。示教内容11.5.上午：菌液制备方法： 一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容） 新鲜浓菌液接种：细菌 大肠埃希菌CMCC（B）44102 金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003 枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501 生孢梭菌CMCC（B）64941（厌氧梭菌） 铜绿假单胞菌CMCC（B）10104培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个-1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1培养1

3、6-18小时。 2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体 培养基（临用前排氧）36±1培养18-24小时。 霉菌及酵母菌 白色念珠菌CMCC（F）98001、 黑曲霉CMCC（F）98003培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1. 取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28培养24小时（可用36±1培养18-24）。2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗

4、脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。二.菌液稀释计数方法细菌：大肠、金葡、枯草、铜绿 稀释：营养肉汤作为稀释剂, 按10-2、10-4、10-5、10-6稀释级10-2 ： 取新鲜浓菌液0.1ml9.9ml充分打匀、10-4 ： 取10-2 0.1ml9.9ml充分打匀10-5 ： 取10-4 1ml9ml充分打匀，取0.2ml×2皿营养琼脂计数10-6 ： 取10-51ml9ml充分打匀取0.2ml×2皿营养琼脂计数 生孢梭菌（厌氧梭菌）：硫乙醇酸盐流体培养基为稀释剂按上述步骤稀释至10-7。10-5、10-6、10-7、分别用50ml硫乙醇酸盐流体培养基计数，各1-

5、2支。细菌计数：36±1培养24小时计数菌落数。 白色念珠菌： 0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释至10-5、10-6计数。 黑曲霉浓菌悬液： 0.9%氯化钠溶液作为稀释剂按上述步骤稀释10-4、 10-5、10-6计数。25-28培养24-36小时计数菌落数。操作要点 ：1. 新鲜浓菌液制备：挑取的菌落充分研匀并摇匀，注意各菌培养时间； 2. 稀释菌液时每一步均应充分摇匀；3. 枯草芽孢杆菌新鲜浓菌液会形成膜或沉淀，稀释菌液时必须充分振摇后静置，取其无块状物的菌液； 4. 黑曲霉接种时注意不能造成对接种环境的污染；点计菌落数时轻拿轻放以免造成计数误差。11.5下午3. 微生

6、物限度检查方法选择预试验 根据样品的溶解性、药效、可能存在的抑菌性等确定预试验方法。计数（细菌、霉菌及酵母菌）验证一般选择顺序：平皿法、平皿稀释法、中和法+平皿稀释法、薄膜过滤法、离心500r/min3-5分钟上清液+平皿稀释法（细菌）、沉降+平皿稀释法（霉菌），离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）+平皿稀释法、离心500r/min3-5分钟上清液+薄膜过滤法（主要用于细菌计数验证）。方法应在符合验证要求的前提下，考虑简便可行。样品：感冒清热颗粒 方法：平皿稀释法示教1. 供试液制备方法：样品10g+稀释剂90ml为1：10供试液。（最低稀释级作为验证供试溶液）。2.计数验证回收试验：

7、 试验组（各1-2皿） 菌液组（各2皿）、 供试品对照组（各2皿）1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+大0.5ml） 大0.5ml 细 1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+金0.5ml） 金0.5ml 霉 1ml 0.5ml1ml 0.5ml 0.2ml 0.1ml（+枯0.5ml） 枯0.5ml 1ml 0.5ml （+白0.5ml） 白0.5ml 1ml 0.5ml （+黑0.5ml） 黑0.5ml （ 共55皿，按规定培养、计数菌落、计算回收率）3.根据回收试验结果确定敏感菌及各试验菌验证方法。操作要点： 1. 试验组：每皿加

8、入1：10供试液应摇匀为均匀混悬液、量要准确、刻度吸管吸取方法一致。平皿中1：10供试液与菌液尽可能不要接触，立即倾注培养基并充分混合均匀。2. 计数验证加入50-100cfu试验菌，菌液的体积以0.4ml-0.6ml为宜；既试验菌液应稀释为100-200cfu/ml，放置2-8备用。11.6上午验证试验：选择3个批号样品进行3次独立验证实验，证明方法的有效性；以敏感菌方法确定计数方法。样品：感冒清热颗粒（不含原药材粉）根据预试验结果确定正式验证方法，预试验回收结果如下表： 菌 种 ( 代)批 号回收率%1ml0.5 ml0.2 ml0.1 ml大肠埃希菌（4）（1：10）65818191金黄

9、色葡萄球菌（4）（1：10）0358994枯草芽孢杆菌（4）（1：10）0438393白色念珠菌（4）（1：10）8690/黑曲霉（4）（1：10）9190结果： 大肠埃希菌0.5ml以下/皿（1ml分注2个皿以上）回收均达到70%以上；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌0.2ml以下/皿（1ml分注5个皿以上）回收均达到70%以上。白色念珠菌、黑曲霉按平皿法回收均达到70%以上。1. 计数方法验证：平皿稀释法：大肠0.5ml/皿；金葡、枯草0.2ml/皿。白念、黑曲霉1ml/皿。（每个大组作1个批号样品计数方法验证、控制菌大肠埃希菌检查方法验证）试验前准备：各试验菌液（100-200cfu/ml）

10、、1：10供试液、平皿、吸管等、BL增菌液试验组 菌液组（各2皿）、 供试品对照组0.5ml+大0.5ml（4皿） 大0.5ml 细0.2ml（6-10皿）0.2ml+金0.5ml（6皿） 金0.5ml 0.2ml+枯0.5ml（6皿） 枯0.5ml 1ml +白0.5ml（2皿） 白0.5ml 霉 1ml （2皿） 1ml +黑0.5ml（2皿） 黑0.5ml （ 共44皿，按规定培养、计数）（注：若所验证的计数方法成立，供试品对照组采用10个皿就同时完成该批号样品细菌计数测定）2.大肠埃希菌检查方法验证试验组 阴性菌对照组 供试品对照组BL 100ml BL 100ml BL 100ml1

11、0ml 1：10供试液 10ml 1：10供试液 10ml 1：10供试液+大肠10-100cfu +金葡10-100cfu 阴性对照：BL 100ml+稀释剂10ml操作要点：1.2.同方法选择预试验3. 正式验证各试验菌验证方法采用预试验结果中回收率在70%以上的方法进行，最终以敏感菌方法确定计数方法；也可采用各菌的回收率均在70%以上的方法进行。11.7上午离心沉淀集菌法、薄膜过滤法（反复使用集菌器）示教两种方法可应用于有抑菌活性的样品，或与其他方法的联用。离心500r/min3-5分钟取上清液 + 平皿稀释法（细菌）、沉降+平皿稀释法（霉菌、酵母菌），离心沉淀集菌法（3000r/min

12、20分钟）+平皿稀释法、离心500r/min3-5分钟上清液+薄膜过滤法（主要用于细菌计数验证）。离心机、刻度离心管（10ml、成对平衡）、吸头、2ml刻度吸管离心500r/min3-5分钟、离心沉淀集菌法（3000r/min20分钟）的操作方法：500r/min3-5分钟（用于细菌检测）：取上清液的方法及要求（上清液不应少于8ml，否则供试液应适当稀释）；3000r/min20分钟弃去上清方法及要求（留管底约2ml，当离心沉淀物超过2ml时供试液应适当稀释）。薄膜过滤法（反复使用集菌器）操作方法：1. 滤膜（不大于0.45um）的选择及准备：水溶性供试液水性膜：滤膜用水浸泡15分钟后装膜，12120分钟灭菌，不烘干，短时间内使；过滤前用稀释液饱和滤膜。有机溶剂供试液有机滤膜：滤膜、滤器过滤前