细胞工程在环境污染治理中的应用

1、Founded in 18951第第4讲讲 细胞工程在环境污染治理中的应用细胞工程在环境污染治理中的应用Founded in 18952/471 细胞工程基础细胞工程基础 细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖细胞工程，是指以细胞为基本单位进行培养、增殖或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从或按照人们的意愿改造细胞的某些生物学特性，从而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生而创造新的生物和物种，以获得具有经济价值的生物产品的技术物产品的技术 上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏 下游工程，将已转化的细胞应用到生产实践中去，

2、以生产下游工程，将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程生物产品的过程 目前细胞工程所涉及的主要技术有：动植物组织和目前细胞工程所涉及的主要技术有：动植物组织和细胞的培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细细胞的培养技术、细胞融合技术、细胞器移植和细胞重组技术、体外授精技术、染色体工程技术、胞重组技术、体外授精技术、染色体工程技术、DNA重组技术和基因转移技术等重组技术和基因转移技术等 Founded in 18953/47细胞工程与基因工程的关系细胞工程与基因工程的关系Founded in 18954/47细胞工程的主要技术及其应用细胞工程的主要技术及其应用Founded in

3、18955/47细胞的大小及分类细胞的大小及分类 细胞是细胞工程操作的主要对象细胞是细胞工程操作的主要对象 细胞是一切生物最基本的结构单位和功能单位细胞是一切生物最基本的结构单位和功能单位 一个细胞体积的最小极限直径是一个细胞体积的最小极限直径是100nm，支原体是，支原体是目前发现的最小最简单的细胞目前发现的最小最简单的细胞 细胞直径的上限可达数百微米，卵细胞不受此限细胞直径的上限可达数百微米，卵细胞不受此限 Founded in 18956/47各种细胞直径的大小各种细胞直径的大小Founded in 18957/47各类细胞直径的比较各类细胞直径的比较Founded in 18958/4

4、7原核细胞和真核细胞的主要区别原核细胞和真核细胞的主要区别Founded in 18959/47细胞周期细胞周期 无丝分裂：最简单的分裂方式，以横裂或纵裂的方无丝分裂：最简单的分裂方式，以横裂或纵裂的方式，一个细胞变为两个细胞式，一个细胞变为两个细胞 有丝分裂：细胞分裂的主要方式，染色体复制后平有丝分裂：细胞分裂的主要方式，染色体复制后平均分配到两个子细胞中，包括间期、前期、中期、均分配到两个子细胞中，包括间期、前期、中期、后期和末期五个阶段；一个间期细胞经过有丝分裂后期和末期五个阶段；一个间期细胞经过有丝分裂变成两个子细胞变成两个子细胞 减数分裂：发生在有性生殖细胞中的一种特殊形式减数分裂：

5、发生在有性生殖细胞中的一种特殊形式的有丝分裂，细胞核和细胞质连续分裂两次，染色的有丝分裂，细胞核和细胞质连续分裂两次，染色体仅复制一次，子细胞染色体数目是原来母细胞的体仅复制一次，子细胞染色体数目是原来母细胞的一半一半 Founded in 189510/47微生物细胞工程微生物细胞工程 应用微生物进行细胞水平的研究和生产，包括各种应用微生物进行细胞水平的研究和生产，包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等的直接利用或获得细胞代谢产物等 微生物的培养：包括不同微生物的营养要求以及各种微生微生物的培养：包括不同

6、微生物的营养要求以及各种微生物的培养方法物的培养方法发酵工程发酵工程 遗传性状的改造：原生质体融合、物理或化学诱变、遗传性状的改造：原生质体融合、物理或化学诱变、DNA重组等方式改变微生物的遗传性状，获得高产菌株重组等方式改变微生物的遗传性状，获得高产菌株 微生物细胞的应用：应用微生物细胞本身如生产单细胞蛋微生物细胞的应用：应用微生物细胞本身如生产单细胞蛋白，或利用微生物细胞进行有用产物的生产白，或利用微生物细胞进行有用产物的生产 Founded in 189511/47微生物原生质体融合技术微生物原生质体融合技术 能够在不具有接合作用的菌株之间，或对感受态尚能够在不具有接合作用的菌株之间，或

7、对感受态尚不了解的菌株，除去细胞壁后，原生质体之间可以不了解的菌株，除去细胞壁后，原生质体之间可以比较容易的进行细胞质融合，进而核融合比较容易的进行细胞质融合，进而核融合 对于链霉菌、酵母菌、丝状真菌等，载体转化较为对于链霉菌、酵母菌、丝状真菌等，载体转化较为困难，消除细胞壁的原生质体是其应用重组困难，消除细胞壁的原生质体是其应用重组DNA技技术的关键环节术的关键环节 Founded in 189512/47微生物原生质体融合微生物原生质体融合 Founded in 189513/47原生质体及其制备原生质体及其制备 除去细胞壁，制备原生质体除去细胞壁，制备原生质体 维持适当的渗透压保持原生质

8、体的稳定性维持适当的渗透压保持原生质体的稳定性 将原生质体置于高渗再生固体培养基后，再生细胞将原生质体置于高渗再生固体培养基后，再生细胞壁壁 渗透压对原生质体的影响渗透压对原生质体的影响 Founded in 189514/47不同微生物细胞的脱壁方法不同微生物细胞的脱壁方法 Founded in 189515/47融合重组融合重组 将两亲株的原生质体混合在一起，促进融合，再把将两亲株的原生质体混合在一起，促进融合，再把融合液涂布在平板上再生，检出重组子融合液涂布在平板上再生，检出重组子 Founded in 189516/47原生质体再生成细胞原生质体再生成细胞 用高渗稳定剂进行稀释，涂布于

9、再生培养基平板上用高渗稳定剂进行稀释，涂布于再生培养基平板上再生，菌落数为原生质体和非原生质化细胞的总合再生，菌落数为原生质体和非原生质化细胞的总合 用水稀释，使原生质体破裂失活，然后涂布于再生用水稀释，使原生质体破裂失活，然后涂布于再生培养基平板上再生，菌落数为非原生质化的细胞数培养基平板上再生，菌落数为非原生质化的细胞数 Founded in 189517/47融合重组的测定融合重组的测定 采用染色体标记的遗传重组体检测，重组子应具有采用染色体标记的遗传重组体检测，重组子应具有两亲株的双重营养缺陷型或者双重抗药性两亲株的双重营养缺陷型或者双重抗药性 直接法：将融合液涂布于不补充两亲株生长所

10、需营直接法：将融合液涂布于不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物的再生培养基平板上，直接筛养物或补充两种药物的再生培养基平板上，直接筛选出原养型或双重抗药性的重组子选出原养型或双重抗药性的重组子 间接法：将融合液涂布于营养丰富的再生板上，使间接法：将融合液涂布于营养丰富的再生板上，使亲株和重组子都再生，然后用印影法复制到选择培亲株和重组子都再生，然后用印影法复制到选择培养基上以检出重组子养基上以检出重组子 Founded in 189518/47原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁的比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁的比较 Founded in 18

11、9519/47革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁成分的比较革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌细胞壁成分的比较Founded in 189520/47 革兰氏阳性菌的原生质体融合革兰氏阳性菌的原生质体融合 培养细胞：对数生长中期培养细胞：对数生长中期 收集细胞：离心收集，高渗培养收集细胞：离心收集，高渗培养 细胞融合：酶解细胞壁，离心，高渗培养，聚乙二醇促进细胞融合：酶解细胞壁，离心，高渗培养，聚乙二醇促进 原生质体融合，高渗稀释原生质体融合，高渗稀释 重组子筛选：选择培养基筛选，鉴定重组子筛选：选择培养基筛选，鉴定 革兰氏阴性菌的原生质体融合革兰氏阴性菌的原生质体融合 肽聚糖层较薄，但结构复杂，含脂质肽

12、聚糖层较薄，但结构复杂，含脂质/蛋白质蛋白质/多糖多糖 溶菌酶处理后仍含部分细胞壁，称为原生质球溶菌酶处理后仍含部分细胞壁，称为原生质球 Founded in 189521/47真核细胞的原生质体融合真核细胞的原生质体融合 真菌细胞壁较为复杂，由几丁质真菌细胞壁较为复杂，由几丁质/葡聚糖等构成，可葡聚糖等构成，可用消解酶、蜗牛酶、纤维素酶或几丁质酶等处理用消解酶、蜗牛酶、纤维素酶或几丁质酶等处理 真菌一般为单倍体，融合后形成真正单倍重组体的真菌一般为单倍体，融合后形成真正单倍重组体的融合子才能稳定传代，杂合双倍体不稳定融合子才能稳定传代，杂合双倍体不稳定 融合过程包括细胞融合形成异核体，不同核

13、融合形融合过程包括细胞融合形成异核体，不同核融合形成二倍体，融合核交换和重组生成重组体成二倍体，融合核交换和重组生成重组体 Founded in 189522/47植物细胞工程植物细胞工程 以植物细胞为基本单位，通过在离体条件下进行培以植物细胞为基本单位，通过在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按预先设计发生改变，从而改良品种或制造新特性按预先设计发生改变，从而改良品种或制造新种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程 植物组织培养技术是一种将植物的组织、器官或细植物组织培养

14、技术是一种将植物的组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术，包括植物培养，胚胎培养，器官胞或植株的技术，包括植物培养，胚胎培养，器官培养，悬浮细胞培养，原生质体培养培养，悬浮细胞培养，原生质体培养 植物细胞和组织培养的理论基础是植物细胞和组织培养的理论基础是植物细胞的全能植物细胞的全能性性 Founded in 189523/47植物细胞与组织的培养方法植物细胞与组织的培养方法 固体培养固体培养 液体培养液体培养 静止培养静止培养 振荡培养振荡培养 连续浸没培养连续浸没培养 定期浸没培养定期浸没培养 悬浮细胞培养悬浮细

15、胞培养 单细胞培养单细胞培养 微室培养微室培养 平板培养平板培养 看护培养看护培养 固定化细胞培养固定化细胞培养 Founded in 189524/47植物细胞与组织培养物产生的有用物质植物细胞与组织培养物产生的有用物质Founded in 189525/47利用植物作为生物反应器生产油脂、糖和蛋白质利用植物作为生物反应器生产油脂、糖和蛋白质Founded in 189526/47植物原生质体制备植物原生质体制备 植物原生质体是植物细胞杂交的良好亲本，也是植植物原生质体是植物细胞杂交的良好亲本，也是植物细胞遗传工程的理想受体，还是细胞生物学和分物细胞遗传工程的理想受体，还是细胞生物学和分子生

16、物学研究中的重要材料子生物学研究中的重要材料 植物原生质体的生物学意义植物原生质体的生物学意义 Founded in 189527/47植物原生质体在细胞工程植物原生质体在细胞工程及理论研究中的作用及理论研究中的作用Founded in 189528/47植物原生质体的制备植物原生质体的制备 植物细胞壁的主要成分是纤维素，半纤维素、果胶植物细胞壁的主要成分是纤维素，半纤维素、果胶质和蛋白质质和蛋白质 机械法：高渗处理，质壁分离，捣碎和切割细胞可机械法：高渗处理，质壁分离，捣碎和切割细胞可获得少量脱壁细胞，损伤大，数量少获得少量脱壁细胞，损伤大，数量少 酶法：纤维素酶酶法：纤维素酶 Founde

17、d in 189529/47植物原生质体的培养植物原生质体的培养 细胞壁再生：适当的培养基细胞壁再生：适当的培养基 分裂：低渗培养基分裂：低渗培养基 愈伤组织或胚状体的形成愈伤组织或胚状体的形成 植株再生植株再生 Founded in 189530/47植物原生质体的融合植物原生质体的融合 也称体细胞杂交也称体细胞杂交 诱导融合的方法诱导融合的方法 物理法：包括显微操作、离心、振动等机械力或电场刺激物理法：包括显微操作、离心、振动等机械力或电场刺激 化学法：各种诱导剂，包括盐、多聚化合物等化学法：各种诱导剂，包括盐、多聚化合物等 膜融合与核融合膜融合与核融合 膜融合分为接触、诱导、融合和稳定四

18、个时期膜融合分为接触、诱导、融合和稳定四个时期 核融合是原生质体融合的关键步骤核融合是原生质体融合的关键步骤 杂合体的选择与鉴别杂合体的选择与鉴别 显微镜鉴别，互补法筛选，分子与细胞生物学方法等显微镜鉴别，互补法筛选，分子与细胞生物学方法等 Founded in 189531/47动物细胞工程动物细胞工程 动物细胞工程中技术最成熟、影响最大的是动物细胞工程中技术最成熟、影响最大的是细胞融合细胞融合 动物细胞的培养要模拟体内生理环境进行离体培养动物细胞的培养要模拟体内生理环境进行离体培养 细胞培养在无菌条件下进行，不出现细胞分化和形成组织细胞培养在无菌条件下进行，不出现细胞分化和形成组织 分为悬

19、浮型细胞培养和贴附型细胞培养分为悬浮型细胞培养和贴附型细胞培养 影响动物细胞体外培养的因素影响动物细胞体外培养的因素 Founded in 189532/47动物细胞融合动物细胞融合 病毒诱导融合，最有效的是副粘病毒病毒诱导融合，最有效的是副粘病毒 化学诱导融合，聚乙二醇等化学诱导融合，聚乙二醇等 电激诱导融合，操作简便、效率高、无残留毒性电激诱导融合，操作简便、效率高、无残留毒性 诱导细胞融合的病毒诱导细胞融合的病毒 Founded in 189533/47PEGPEG诱导细胞融合的可能机制诱导细胞融合的可能机制 Founded in 189534/47杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选Found

20、ed in 189535/47单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 由同一抗原产生的不同的抗体统称为多克隆抗体由同一抗原产生的不同的抗体统称为多克隆抗体 由特定的由特定的B淋巴细胞培养繁殖出的大量遗传性高度一淋巴细胞培养繁殖出的大量遗传性高度一致的细胞群体分泌出的抗体称为单克隆抗体致的细胞群体分泌出的抗体称为单克隆抗体 将将B细胞与肿瘤细胞融合，获得的既能产生单一抗体细胞与肿瘤细胞融合，获得的既能产生单一抗体又能在体外无限生长的杂合细胞，称为又能在体外无限生长的杂合细胞，称为杂交瘤细胞杂交瘤细胞 Founded in 189536/47利用杂交瘤细胞制备利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体的过程单克隆抗体

21、的过程Founded in 189537/47克隆克隆“多莉羊多莉羊”细胞融合技术的高峰细胞融合技术的高峰Founded in 189538/472 细胞工程在环境污染治理中的应用细胞工程在环境污染治理中的应用细胞融合技术已应用于环境污染物的检测、难降解物质的降解、优良菌种细胞融合技术已应用于环境污染物的检测、难降解物质的降解、优良菌种的培育、抗性植物的培养的培育、抗性植物的培养 动物细胞融合技术：动物细胞融合技术： 生产单克隆抗体检测环境中痕量污染物生产单克隆抗体检测环境中痕量污染物免疫检测法免疫检测法 植物细胞融合技术：植物细胞融合技术： 培育抗性植物，抗除草剂培育抗性植物，抗除草剂 植物

22、修复重金属污染的土壤植物修复重金属污染的土壤 微生物细胞融合技术：微生物细胞融合技术： 融合脱氢双香草醛降解菌，提高降解率融合脱氢双香草醛降解菌，提高降解率 融合纤维素分解菌，可同时实现对纤维素的分解融合纤维素分解菌，可同时实现对纤维素的分解 融合降解苯甲酸酯和融合降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯（不能利用甲苯）及降解苯甲酸酯和甲苯氯苯甲酸酯（不能利用甲苯）及降解苯甲酸酯和甲苯的细菌（不能利用的细菌（不能利用3-氯苯甲酸酯），可实现全部降解及氯苯甲酸酯），可实现全部降解及1,4-二氯苯甲酸酯的新二氯苯甲酸酯的新降解能力降解能力 融合乙二醇降解菌、甲醇降解菌、苯甲酸和苯的降解菌，获得同时降解能力，融

23、合乙二醇降解菌、甲醇降解菌、苯甲酸和苯的降解菌，获得同时降解能力，可用于化纤废水的处理可用于化纤废水的处理 Founded in 189539/47抗性植物在生物修复中的作用抗性植物在生物修复中的作用 植物修复是利用植物的一植物修复是利用植物的一系列生理、生化过程部分系列生理、生化过程部分或完全修复和消除被污染或完全修复和消除被污染土壤、水体和空气中的污土壤、水体和空气中的污染物染物 植物可通过吸附、吸收及植物可通过吸附、吸收及超积累、转移和挥发等方超积累、转移和挥发等方式降解和清除环境中的有式降解和清除环境中的有毒物质毒物质 植物还可与根际微生物协植物还可与根际微生物协同作用实现对污染物的降

24、同作用实现对污染物的降解解 植物修复中可能涉及的各种过程植物修复中可能涉及的各种过程 Founded in 189540/47植物对非生物胁迫应答的机制植物对非生物胁迫应答的机制非生物胁迫因子，特别是干旱和盐分，可导致植物在形态和生理生化代谢非生物胁迫因子，特别是干旱和盐分，可导致植物在形态和生理生化代谢上进行一些调整，以适应或忍耐环境胁迫上进行一些调整，以适应或忍耐环境胁迫 揭示植物对非生物胁迫应答的机理，发现相关基因，可以应用于植物胁迫揭示植物对非生物胁迫应答的机理，发现相关基因，可以应用于植物胁迫耐受的遗传改造，以提高产量、改良作物品质和改善生态环境耐受的遗传改造，以提高产量、改良作物品

25、质和改善生态环境 植物对非生物胁迫可能的应答机制植物对非生物胁迫可能的应答机制 Founded in 189541/47重金属污染的植物修复重金属污染的植物修复 适合重金属污染生物修适合重金属污染生物修复的植物特征复的植物特征 能够超量积累重金属，最能够超量积累重金属，最好是地上部分积累好是地上部分积累 对重金属积累浓度有较高对重金属积累浓度有较高的耐受力的耐受力 生长快，生物量高生长快，生物量高 易收割易收割 基因工程设计耐受、积累重金属植物的一般策略基因工程设计耐受、积累重金属植物的一般策略 Founded in 189542/47有机污染物的植物修复有机污染物的植物修复几类主要有机污染物

26、、清除这些污染物的植物种类和清除机制几类主要有机污染物、清除这些污染物的植物种类和清除机制 Founded in 189543/47 植物去除环境中有机污染物的机理植物去除环境中有机污染物的机理 植物直接吸收有机污染物植物直接吸收有机污染物 植物根系释放分泌物和酶植物根系释放分泌物和酶 植物和根际微生物联合作用植物和根际微生物联合作用 综合分析污染物的种类、特性和具体环境条件，选综合分析污染物的种类、特性和具体环境条件，选择合适的植物种类并制定技术方案择合适的植物种类并制定技术方案 应用转基因技术提高植物降解除草剂的效率应用转基因技术提高植物降解除草剂的效率 表达人表达人CYP2B6基因的水稻

27、植株对除草剂呋草黄的降解作基因的水稻植株对除草剂呋草黄的降解作用提高了至少用提高了至少60倍倍 共表达大豆共表达大豆CYP71A10和和P450还原酶基因的烟草植株，对还原酶基因的烟草植株，对苯脲型除草剂降解能力提高苯脲型除草剂降解能力提高20-30% Founded in 189544/47抗体技术在污染治理中的应用抗体技术在污染治理中的应用 免疫分析和环境监测免疫分析和环境监测 欧盟：饮用水中某些有机污染物的浓度欧盟：饮用水中某些有机污染物的浓度0.1g/L 抗体片段作为信号分子和传感器的应用抗体片段作为信号分子和传感器的应用 监测环境的化学污染监测环境的化学污染 监测环境的微生物污染监测环境的微生物污染 监测食品的变质情况监测食品的变质情况 监测水果的储藏和成熟情况监测水果的储藏和成熟情况 监测蔬菜的变质情况监测蔬菜的变质情况 相对于色谱和质谱技术，免疫分析技术快速、简