SMP-QC0028微生物鉴定管理规程

1、、目的:微生物鉴定管理规程编写/修订人/日期年月曰部门/姓名品质部/A 审核人/日期年月曰部门/姓名品质部/第二审核人/日期年月曰部门/姓名品质部/批准人/日期年月曰部门/姓名质里负贝人/执行日期2018 年 11 月 01 日颁发部门品质部分发部门各职能部门签收/日期：规范菌种以及控制菌检查中疑似菌的鉴定程序，以减少菌种污染和生长特性的改变，确保实验室安全和实验结果可靠。二、范围：适用于实验室所用标准储备菌株和控制菌检查中疑似菌的鉴定。三、职责：品质部：确保使用的菌株是可靠的，准确鉴别样品中控制菌，保证实验结果可靠。四、内容：1、试验菌株：大肠埃希菌(Escherichiacoli)CMCC

2、(B)44102金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC(B)26003枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)CMCC(B)63501白色念珠菌(Candidaalbicans)CMCC(F)98001黑曲霉(Aspergillusniger)CMCC(F)98003铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CMCC(B)10104沙门菌(Salmonella)CMCC(B)500942、菌种确认试验的主要内容：2.1 菌种的纯度确认。2.1.1试验内容。菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单

3、菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽胞等特征应相似。2.1.2菌种的特性确认。生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。2.1.3菌种的确定方法。用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型

4、的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。3、大肠埃希菌的确认：5.1 菌落形态。5.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至胰酪大豆月东液体培养基或胆盐乳糖中，经 35c 培养1824h 后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。5.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂（EMB）琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35c 培养 1824h 后，观察结果。曙红亚甲蓝琼脂（EMB）平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。麦康凯琼脂平

5、板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。5.2 革兰染色、镜检。5.2.1革兰染色。以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（3.1.2、）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰 23 次干燥使固定。滴加结晶紫染液，染色 1min,水洗干净。滴加碘液，媒染 1min,水洗，以滤纸吸干余水。滴加 95%乙醇，脱色 2030s,至流出液无色，水洗。滴加沙黄染液，复染 1min,待干后，镜检。5.2.2染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。5.2.3镜检结果应是：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽抱，多有鞭

6、毛，以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。5.3 生化试验。5.3.1靛基质试验（I）:取菌落形态（、）的培养物接种于蛋白月东水培养基中，35C培养 24-48h,沿管壁缓慢加入口引喋试剂，轻轻摇动试管，于两者接触面出现红色为阳性，无色为阴性。5.3.2甲基红试验（M）:取菌落形态（、）的培养物接种于葡萄糖蛋白月东水培养基中，培养24 天后，于培养液中加入甲基红指示液 23 滴（约 1ml 培养液加指示液 1 滴），轻微摇动，立即观察，呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性，黄色为阴性。5.3.3乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）:取菌落形态（、）的培养物接种于葡萄糖蛋白月东水培养基中， 35c

7、培养482h,于2ml培养液中加入6%a-蔡酚乙醇试液1ml,混匀， 再加40%氧化钾试液0.4ml,充分振摇，在 4h（通常在 20min）内出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。5.3.4枸檬酸盐利用试验（C）:取菌落形态（、）的培养物接种于枸檬酸盐培养基斜面上，35c培养 2-4 天，培养基斜面有菌苔生成，培养基中的澳麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。5.3.5乳糖发酵试验： 取菌落形态 （、 ） 的培养物接种于乳糖发酵管， 培养 24-48h,观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为澳麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论

8、大小都是产气）。4、金黄色葡萄球菌的确认：1.1 菌落形态。1.1.1取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经 35c 培养 1824h 后，呈均匀浑浊生长，繁殖较多时易产生沉淀，沉淀易被摇散。1.1.2取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板和卵黄氯化钠琼脂平板上培养 2472h 观察结果。甘露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径 0.7-1mm。卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径 1-2mm1.2 革兰染色、镜检。1.2.1革兰染色（见大肠埃希菌检查法 3.2.1）1.2.2镜检结果：

9、为革兰阳性球菌，菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较小，菌体大小不一。无芽抱，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。1.3生化试验。1.3.1血浆凝固酶试验。试管法：取无菌试管（10m 怀 100mm3 支，各加入血浆和 0.9%无菌氯化钠溶液（1:1）0.5ml,1 支加入营养肉汤培养液 0.5ml 作为阳性对照：1 支加入无菌营养肉汤 0.5ml 作为阴性对照。两管同时置 37c 水浴或恒温培养箱，3h 后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24ho检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿大），仔细观察。阳性对照管：血浆和无菌水混合液加金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物，在 3

10、h 后开始观察直至 24h。结果：血浆凝固。阴性对照管：血浆和无菌水混合液加稀释液，在 3h 后开始观察直至 24ho 结果：血浆流动自如。5、枯草芽抱杆菌的确认：1菌落形态。1.10取枯草芽抱杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经 35c 培养 1824h 后，呈浑浊生长。1.10取上述培养物划线接种于营养琼脂平板上，培养 2427h 观察结果：菌落为灰色、干燥、皱缩、无典型卷发状。1革兰染色、镜检。1.11革兰染色（见大肠埃希菌检查法 3.2.1）。1.11镜检结果：革兰阳性芽抱杆菌芽抱为椭圆到柱状，位於菌体中央或稍偏，芽抱形成后菌体不膨大。6、白色念珠菌的确认：菌落形态。取白色念珠菌新鲜培

11、养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基中，经 35c 培养 2448h 后，呈浑浊生长。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，经 3035c 培养 2448h（必要时延长至 72 小时）。观察结果：呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。取上述（6.1.2）培养物接种至白色念珠菌显色培养基平板上，经 3035c 培养 2448h（必要时延长至 72 小时）。观察结果：平板上为绿色或翠绿色的菌落生长。革兰染色、镜检及芽管试验取上述（6.1.3）培养物接种至 1 嫖山梨酯 80-玉米琼脂培养基上，培养 2448h。取培养物进行染色，镜检及芽管试

12、验。革兰染色（见大肠埃希菌检查法 3.2.1）芽管试验：挑取 1%聚山梨酯 80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置 3537c 培养 13h,置显微镜下观察，可见到由抱子长出短小芽管。镜检结果：革兰阳性芽抱杆菌芽抱为厚膜抱子、菌丝、芽管。7、黑曲霉菌的确认：7.1 镜检：可见抱子，菌丝。8、铜绿假单胞菌的确认：取铜绿假单胞菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经 35c 培养 1824h 后，液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。取上述培养物接种于澳化十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养 1824h 后，观察结

13、果：呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。8.2 革兰染色、镜检。革兰染色（见大肠埃希菌检查法 3.2.1）。镜检结果：铜绿假单胞菌为革兰阴性、无芽抱杆菌。单个，成对或成短链排列。氧化酶试验。取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的 1%二盐酸 N,N-二甲基对苯二胺试液，在 30 秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。若斜面培养物为非革兰阴性无芽泡杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单抱菌。否则，应进行绿侬菌素试验。绿侬菌素（Pyocyanin）试验。取斜面培养物接种于 PDP 琼脂培养基斜面上

14、，培养 24 小时，加三氯甲烷 35ml 至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入 1mol/L 盐酸试液约 1ml,振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿侬菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的 PDF 琼脂培养基斜面同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阳性，判断供试品检出铜绿假单胞菌。上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。9、沙门菌的确认：取沙门菌新鲜培养物至胰酪大豆脐液体培养基中，经 35c 培养 1824h 后

15、，呈均匀浑浊生长。取上述培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，3035C 培养1848 小时。观察结果：菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。革兰染色、镜检。革兰染色（见大肠埃希菌检查法 3.2.1）镜检结果：沙门氏菌为革兰阴性杆菌，无芽抱，两端钝圆。除个别菌外，都具有鞭毛，能运动。生化试验。三糖铁琼脂培养基。用接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养 1824 小时。结果判断：斜面红色、底层黑色并显示黄色；斜面红色，底层为黄色；斜面黄色、底层黄色或黑色。靛基质试验。将 TSI 或 TSA 斜面培养物作生化试验。用接种环沾取少许培养

16、物，接种到蛋白陈水培养基中，培养 24h,沿管壁滴加 24滴靛基质试液后，轻摇试管，液面醇层出现玫瑰红色为阳性。沙门菌应为阴性反应。尿素酶试验。用接种环沾取少许培养物，划线接种于月尿琼脂斜面，培养 24h,斜面变为红色为阳性反应。沙门菌属为阴性反应。赖氨酸脱竣酶试验（阳性）用接种环沾取少许培养物，接种于赖氨酸脱竣酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸脱竣酶培养基的同样培养基中作为对照，培养 24h48h,观察结果：对照管黄色产酸，试验管呈紫色为阳性反应；对照管黄色，试验管黄色为阴性反应；沙门菌应为阳性反应。氧化钾试验。将培养物先接种至肉汤培养基中，培养 1824h,用接种环沾取 1 环培养液，接种至氧化钾培养基内，另取 1 环培养液接种至不含氧化钾的同种对照培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养 2448h,观察结果：对照管内有菌生长（混浊），试验管内也有菌生长为阳性反应；对照管有菌生长（混浊），而试验管无菌生长（清亮）为阴性反应。沙门菌应为阴性反应。动力检查。用接种环沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养 24h,观察结果：有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌只能沿穿刺线生长，不扩散，培养基可见清晰透明状；无动力表现的培养物，应