生物技术常用技术(1)-PCR技术及应用

1、 Kary Mullis 19933PCRAgarose gel electrophoresisUV 检测检测3-4 hours夹心杂交夹心杂交模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低BufferBuffer对样品不合适对样品不合适引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级

2、结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正对照正对照(marker?)(marker?)有条带，而样品则无有条带，而样品则无； 非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。引物特异性差引物特异性差模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高酶量过多酶量过多MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高退火温度偏低退火温度偏低循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策重新设计引

3、物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度适当减少酶量适当减少酶量降低镁离子浓度降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增 拖尾(与非特异性扩增条带明显不同，非特异性扩增带有明显的条带分隔。) 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。 M 1 2模板不纯模板不纯BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策纯化模板纯化模板更换

4、更换BufferBuffer适当提高退火温度适当提高退火温度适量用酶适量用酶适当降低适当降低dNTPdNTP和镁离子的和镁离子的浓度浓度减少循环次数减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况) ) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。打开标本管盖时样品飞溅，造成样品间相互污染。使用带有污染的试剂。使用带有污染的试剂。公用试剂如液体石蜡等污染。公用试剂如液体石蜡等污染。操作时手套引起的交叉污染。操作时手套引起的交叉污染。加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常带有加样器通道易形成气溶胶，气溶胶常

5、带有PCRPCR产物污产物污染，可用有滤筛的吸头避免此类污染。染，可用有滤筛的吸头避免此类污染。实验室污染。实验室污染。 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策： PCRPCR前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。前后工序分室操作，试剂器材分室存放低温贮存。除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均除酶及不能耐高温的物质外，凡耐高温的试剂器材均高压灭菌。高压灭菌。TipTip头、头、EppendorfEppendorf管等最好一次性使用。管等最好一次性使用。操作人员必须戴手套进行操作。操作人员必须戴手套进行操作。试剂小量分装保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，试

6、剂小量分装保存，用前先离心，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外防止开盖时液体溅出。时液体溅出。（2）逆转录逆转录RT-PCR（reverse transcription-PCR）逆转录酶：逆转录酶：AMV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为42）和）和MoMLV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为37）逆转录引物：逆转录引物：随机引物；随机引物；Oligo(dT)；特异；特异性引物。性引物。one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、

7、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和缓冲液，直接以和缓冲液，直接以mRNA 为模板进行逆转录和为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法扩增，称为一步法RT-PCR。基本原理：基本原理：抽提细胞总抽提细胞总RNA或或mRNA，在逆转录酶，在逆转录酶作用下合成作用下合成cDNA，通过，通过DNA末端转移酶在末端转移酶在cDNA 3端加上端加上poly(dG)尾。据此设计锚定引物尾。据此设计锚定引物poly(dC)，为提高扩增特异性，为提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定在十二聚以上，锚定引物引物5端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的序列信息。根据已知的3端序列设计基因特异性引端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行物，与锚定引物一起进行PCR扩增。扩增。用途：用途：检测检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。反向反向PCR已知序