质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点ppt课件

1、质谱分析法鉴定多形汉逊酵母质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点的磷酸化位点Identification of phosphorylation sites in Hansenula polymorpha Pex14p by mass spectrometry Pex14p是过氧化物酶体膜蛋白，它既参与过氧化物酶体的增殖，也参与过氧化物酶体的选择性降解。 作者之前发现，活体多形汉逊酵母中的Pex14p 是以磷酸化形状存在的。 但是，详细的磷酸化位点和生理作用尚未知道。 本文经过质谱分析确定了Pex14p的详细磷酸化位点，并试图分析其在过氧化氢酶体增殖和吞噬中的作用。 H6-Pex14

2、p的cDNA和pHIPX4 载体衔接，得到pHIPX4-H6PEX14，转化pex14细胞。 用含甲醇的培育基诱导酵母表达，培育基中仅含有32P的磷酸盐。酵母中过氧化物酶体大量增殖。 随着时间增长， Pex14p中的磷酸化位点都会变成32P标志的。 质谱分析 A 从过表达酵母菌株中提取H6-Pex14p ，然后进展SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色 B 划线部分是观测的多肽序列，带*的是磷酸化位点 C 经过分析质谱图得知，磷酸化位点在Thr248和Ser258 为了进一步研讨磷酸化的生理作用，作者选育三种不同的突变株，分别是T248A 、S258A 和T248A/S258A 突变体。 分别用Al

3、a取代T248和S258Pex14p的western blot结果中， 野生型WT呈现三条带 推测T248A的Pex14p是因受激发而呈现 三条带，详细缘由尚不明确 S258A 和T248A/S258A 突变体分别呈现 两条带和一条带野生型WT的酵母细胞，转移到甲醇平板后，产生大量过氧化氢酶体，磷酸化的Pex14p迅速诱导产生，非磷酸化化的Pex14p迅速减少，直至24h后检测不到T248A 突变体的Pex14p动态与WT的很类似S258A突变体的Pex14p 动态与WT大体类似，只是直到24h还存在着非磷酸化带T248A/S258A 双突变体只呈现一条非磷酸化的Pex14p 条带 之后转移到

4、葡萄糖培育基中，此时过氧化物酶体被选择性吞噬。 在吞噬过程中，过氧化氢基质蛋白也被降解，如AOX。转移到葡萄糖培育后，WT细胞中磷酸化的Pex14p由于吞噬作用在最初的0.5小时内迅速减少相比之下，非磷酸化的Pex14p呈现相对缓慢的降解速度Pex14p降解的过程中，一切的突变体表现出了一样的动力学特征在野生型细胞中，通常是经过醇氧化酶AOX)的降解来判别过氧化物酶体吞噬作用的各种细胞中AOX的降解情况都非常类似。并且降解产生的低分子量的产物也已被检测到去核后上清PNS30000g离心得到 细胞器膜球团P和上清 S AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白去核后上清PNS30000g离心得到 细胞器膜球团P和上清 S AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白在过氧化氢酶体诱导的条件下，Pex14p 在Thr248和Ser258的磷酸化作用，不影响基质蛋白转运进入过氧化氢酶体。 在过氧化物酶体增殖和选择性降解过程中，与野生型相比，突变体并没有明显的表型差别。 Pex14p的磷酸化位