植物细胞大规模培养ppt课件

1、第十二章植物细胞大规模培育第十二章植物细胞大规模培育 教教 学学 内内 容容 1、植物细胞培育基 2、植物细胞培育方法 3、植物细胞的大规模培育技术 4、影响植物细胞培育的要素 5、植物细胞培育反响器前前 言言 植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超越2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的阅历。李时珍1953编纂的巨著中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾祸频繁。即使是大规模人工栽培依然不能从根本上满足人类对

2、经济植物日益增长的需求。因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培育植物细胞以提取其天然产物的大胆想象。 中草药中草药 Reinhard等1968首先将这种想象转变成现实，消费出了哈尔碱(harmine)。紧接着Kaul等1969、Furrya等(1972)和Teuscher等1973分别培育植物细胞获取了其中的薯蓣(yu山药皂苷、人参皂角苷和维斯纳精visnagin。如今一些兴隆国家已集中相当数量的人力、财力潜心开辟这个经济潜力非常宏大的消费领域。目前世界最大批量工业化培育细胞烟草细胞已达2万升20吨。我国在“八五、“九五和“863方案中延续拨款资助工业化培育红豆杉细胞

3、消费抗肿瘤药物紫杉醇的研讨，目前已到达60mg/L的世界先进程度。 植物细胞培育是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培育基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，经过继代培育使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。 鉴于有些产物的独一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且遭到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需求。采用大规模植物细胞培育技术就可以直接消费这些产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的经过大规模植物细胞培育消费的产品，经过大规模培育紫草细胞短时间内就可大量消费紫草宁。表12-1是植物细胞培育和从完好的植物

4、消费紫草宁的比较。 目前，植物细胞培育技术已在农业、医药、食品、化装品、香料等领域广泛用于大规模消费有价值的产品。小规模的细胞培育通常在培育瓶中完成，而大规模的培育可在发酵罐中进展。 问题问题请列举出请列举出3至至5种由大规模培育植物细胞获得的有经剂价值的产物。种由大规模培育植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精精visnagin 与动物细胞培育相比，植物细胞培育的最大优点是植物细胞可以在简单的合成培育基上正常生长。用于植物细胞培育的根底培育基成分根本上与整个植物的要求一样，但是用于培育细胞、组织和

5、器官的培育基需求满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培育系统，培育基的根本营养成分可作适当的调整。一、植物细胞培育基 植物细胞培育基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调理素和有机添加剂等。 无机盐类 包括： 无机盐浓度普通为多少？ 微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。 碳源和能源 P225 维生素 植物细胞的生长都需求硫胺素。可在植物细胞培育基中参与烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培育通常需求大多数必需维生素。1、植物细胞培育基的组成、植物细胞培育基的组成 植物生长激素 大多数植物细胞培育基中都含有天然的或合成的植物生长激素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、

6、赤霉素和零落酸等四大类。 有机氮源 通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。P225 有机酸 参与丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物，可以保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培育基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受才干至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。 复合物质 在植物细胞的培育过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。 目前运用最广的根底培育基主要有MS、B5、E1以及N6培育基。表12-2列出了这几种常用的植物细胞培育基。1、植物细胞培育基组成包括、植物细胞培

7、育基组成包括 等。等。问题问题2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培育上有何作用？、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培育上有何作用？2、植物细胞培育基的制备、植物细胞培育基的制备 制备培育基时，培育基中运用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激制备培育基时，培育基中运用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在运用前需求进展重结晶素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在运用前需求进展重结晶提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精的酒精中，其酒

8、精-水水溶液要用吸附法进展脱色处置，然后渐渐参与蒸馏水，略微加热后，再稀释至所溶液要用吸附法进展脱色处置，然后渐渐参与蒸馏水，略微加热后，再稀释至所需体积。需体积。 配制培育基的用水应严厉地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器皿制备的蒸馏水最好。培育基的PH值运用0.5m0l.l-1的HCL或0.2 m0l.l-1的NaOH进展调理。当需求运用固体培育基时，须参与琼脂。 配制好的培育基按要求装入三角瓶或试管中，121下灭菌20min，待冷却后就可以运用。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作参与到已灭菌的培育基中。

9、植物细胞培育基的制备植物细胞培育基的制备是非常严厉的是非常严厉的植物细胞培育基制备时对水有哪些植物细胞培育基制备时对水有哪些严厉要求？严厉要求？问题问题 由于培育基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此往往把培育基配制成运用浓度的10或100倍的母液，运用时再按需求稀释至运用浓度。培育基母液或经稀释后的培育基应置于冰箱内，在10度以下保管待用。普通含有有机物或激素类物质的培育基母液或稀释液最好保管时间不超越十天。 在培育基配制过程中需求留意的是，为了防止在高浓度下，培育基份间相互作用产生沉淀，诸如CaCL2、KI、EDTA的钠或亚铁盐需求单独配制保管，运用时再稀释混合。二、植

10、物细胞培育方法 原生质体培育：原生质体培育： 植物的体细胞二倍体细胞经过纤维素酶处置后可去掉细胞壁，获得的去壁植物的体细胞二倍体细胞经过纤维素酶处置后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培育基中可以生长、分裂，最后可以细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培育基中可以生长、分裂，最后可以长成植株。实践过程中，可以用不同植物的原生质体进展交融与体细胞杂交，由此长成植株。实践过程中，可以用不同植物的原生质体进展交融与体细胞杂交，由此可获得体细胞杂交的植株。可获得体细胞杂交的植株。 植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织 植物细胞培

11、育方法主要有-等。单倍体细胞培育： 主要用花药在人工培育基上进展培育，可以从小孢子雄性生殖细胞直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是经过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。 固体培育：固体培育： 固体培育是在微生物培育的根底上开展起来的植物细胞培育方法。固体培育基的凝固体培育是在微生物培育的根底上开展起来的植物细胞培育方法。固体培育基的凝固剂除特殊研讨外，几乎都运用琼脂，浓度普通为固剂除特殊研讨外，几乎都运用琼脂，浓度普通为6%-10%。接种资料放在培育基上，。接种资料放在培育基上，原生质体固体培育那么需混入培育基内进展嵌合培育，或者使原生质体在固体原生质体固体培育那么需混入培育基内

12、进展嵌合培育，或者使原生质体在固体-液体之液体之间进展双相培育。间进展双相培育。 液体培育：液体培育： 液体培育也是在微生物培育的根底上开展起来的植物细胞培育方法。液体培育可分液体培育也是在微生物培育的根底上开展起来的植物细胞培育方法。液体培育可分为静止培育和振荡培育等两类。静止培育不需求任何设备，适宜于某些原生质体的培为静止培育和振荡培育等两类。静止培育不需求任何设备，适宜于某些原生质体的培育。振荡培育需求摇床或转床等设备使培育物和培育基坚持充分混和以利于气体交换。育。振荡培育需求摇床或转床等设备使培育物和培育基坚持充分混和以利于气体交换。 悬浮培育：主要悬浮培育：主要 植物细胞的悬浮培育是

13、一种使组织培育物分别成单细胞并不断扩增的方法。在进展植物细胞的悬浮培育是一种使组织培育物分别成单细胞并不断扩增的方法。在进展细胞培育时，需求提供容易破裂的愈伤组织进展液体振荡培育，愈伤组织经过悬浮培细胞培育时，需求提供容易破裂的愈伤组织进展液体振荡培育，愈伤组织经过悬浮培育可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培育的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体育可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培育的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培育条件下能获得分散的单细胞，而严密不易碎的愈伤组织就不能到达上述目的。培育条件下能获得分散的单细胞，而严密不易碎的愈伤组织就不能到达上述目的。 固定化培育固定化培育 主要主要 固

14、定化培育是在微生物和酶的固定化培育根底上开展起来的植物细胞培育方法。该固定化培育是在微生物和酶的固定化培育根底上开展起来的植物细胞培育方法。该法与固定化酶或微生物细胞类似，运用最广泛的、可以坚持细胞活性的固定化方法是法与固定化酶或微生物细胞类似，运用最广泛的、可以坚持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。三、植物细胞的大规模培育技术 目前用于植物细胞大规模培育的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培育和植物目前用于植物细胞大规模培育的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培育和植物细胞或原生质体的固定化培育。细胞或原生质体的固定化培育。 1、植物细胞的大规模悬

15、浮培育、植物细胞的大规模悬浮培育 前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者那么相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。 1953年Muir胜利地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进展了悬浮培育。继之Tulecke和Nickell1959推出了一个20L的植物细胞封锁式悬浮培育系统。经蒸汽灭菌后接入目的培育物，以无菌紧缩空气进展搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再添加且次生物质达一定含量时，收获细胞，提取产物。他们用此系统胜利地培育了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。构造简单，易于操作是本系统的突出优点。但它的消费效率不够高，次生物质累积的量也较少。阅读课本P228-23010分钟悬浮培

16、育中的植物细胞的特性悬浮培育中的植物细胞的特性 由于植物细胞有其本身的特性，虽然人们曾经在各种微生物反响器中胜利地进展了植物细胞的培育，但是植物细胞培育过程的操作条件与微生物培育是不同的。植物细胞培育液的流变特性植物细胞培育液的流变特性 1、在悬浮培育时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团方式存在？、在悬浮培育时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团方式存在？问题问题2、植物细胞以细胞团方式存在存在缘由？、植物细胞以细胞团方式存在存在缘由？3、人们常用粘度这一参数来描画植物细胞培育液的流变学特征，培育液粘度、人们常用粘度这一参数来描画植物细胞培育液的流变学特征，培育液粘度的变化主要是由于什么引起，而

17、不是分泌物引起？的变化主要是由于什么引起，而不是分泌物引起？植物细胞培育过程中的氧传送植物细胞培育过程中的氧传送 由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量程度对细胞的生长同样相当重要。研讨发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2 ，如在空气中混以2%-4%的CO2可以消除高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此，对植物细胞培育来说，在要求培育液充分混合的同时， CO2和氧气的浓度只需到达某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培育有时间需求通入一定量的CO2等气体。 把课本的两句话划线把课本的两句话划线4、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利缘

18、由？、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利缘由？5、植物细胞培育时为什么有时要通入一定量的、植物细胞培育时为什么有时要通入一定量的CO2气体？气体？泡沫和外表粘附性泡沫和外表粘附性 6、植物细胞培育时产生的泡沫有何特点？、植物细胞培育时产生的泡沫有何特点？悬浮细胞的生长与增殖悬浮细胞的生长与增殖 悬浮培育时细胞的生长曲线如图12-1所示，细胞数量随着时间的变化曲线呈现S形。在细胞接种到培育基中最初的时间内细胞很少分裂，阅历一个延迟期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的的减慢期和停顿生长的静止期。整个周期阅历时间的长短植物种类和起培育细胞密度的不同而不同。在细胞培育

19、过程中，普通在静止期或静止期前后进展继代培育，详细时间可根据静止期细胞活力的变化而定。 图图12-1 悬浮培育时细胞的生长曲线悬浮培育时细胞的生长曲线0培育时间d细胞数细胞数静止期静止期减慢期减慢期直线生长期直线生长期对数生长期对数生长期延滞期延滞期 由于悬浮培育具有：添加培育细胞与培育液的接触面，改善营养供应；可带走培育物产生的有害代谢产物，防止有害代谢产物部分浓度过高等问题；保证氧的充分供应等三个根本优点，使悬浮培育细胞的生长条件比固体培育有很大的改善。 细胞团和愈伤组织的再构成和植株的再生细胞团和愈伤组织的再构成和植株的再生 悬浮培育的单个细胞在3-5d内即可见细胞分裂，经过一星期左右的

20、培育，单个细胞和小的聚集体不断分裂而构成肉眼可见的小细胞团。大约培育两周后，将细胞分裂再构成的小愈伤组织团块及时转移到分化培育基上，延续光照，三星期后可分化出试管苗。 紫杉醇是近年发现的重要的抗癌药物，能有效地治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科癌症。但由于紫杉醇是从珍稀植物紫杉提取的，所以如何得到充足的药物不断是医学和环境学家争论的问题。紫杉醇的消费只能经过大量的砍伐这种珍稀植物，这显然将对环境产生不良影响。所以目前科学家们正在开展紫杉醇细胞培育法进展消费和研讨。我国在“八五、“九五和“863方案中延续拨款资助工业化培育和消费抗肿瘤药物紫杉醇的研讨，目前已到达60mg/L的世界先进程度。复习复习请列举出

21、请列举出3至至5种由大规模培育植物细胞获得的有经剂价值的产物。种由大规模培育植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精精visnagin2、植物细胞或原生质体的固定化培育、植物细胞或原生质体的固定化培育 由于固定化植物细胞培育比自在悬浮细胞培育具有较高的机械稳定性、产率，更长的稳定消费期等许多优点，因此，通常采用固定化来进展植物细胞的培育。这类培育包括了植物细胞和原生质体的固定化培育。植物细胞固定化的常用方法有哪些？问题问题 细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的外表。其前提就是经过悬浮培

22、育获得足够数量的细胞。 针对上述细胞悬浮培育的缺陷，Brodelius等1979初次报道了用海藻酸钙胜利固定培育橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进展调控，而且有利于在细胞团间构成各种化学物质和物理要素的梯度，这能够是调控高产次生物质的关键。 海藻细胞的固定化海藻细胞的固定化 为什么说植物细胞固定化培育更有利于次生生物的生成？为什么说植物细胞固定化培育更有利于次生生物的生成？问题问题 以下简要引见褐藻钙固定植物细胞的技术道

23、路：大量培育植物细胞 混合 倒入塑料注射器 渐渐滴入含氯化钙的培育基一定浓度的海藻酸钠溶液 海藻酸钙固定的细胞团 小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进展。配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。经过离心或过滤搜集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，渐渐滴入到含有CaCl2的培育基中，不断搅拌，使之构成球形颗粒，然后经过过滤搜集颗粒，用含有CaCl2的培育基清洗后，转入装有培育基的摇瓶中进展培育。图图12-2大规模植物细胞固定化安装大规模植物细胞固定化安装含含CaCl2的培育基的培育基盖子盖子空气出口空气出口海藻酸钠海藻酸钠+细胞悬浮液细胞悬浮液喷嘴

24、喷嘴无菌空气入口无菌空气入口 大规模固定化植物细胞的大规模固定化原那么上可根据上述方法进展，但是不能再用塑料注射器，而需求采用如图12-2所示的大规模细胞固定化安装进展细胞的固定化。 卡拉胶固定化卡拉胶固定化 P230 琼脂糖固定化琼脂糖固定化 P231 琼脂固定化琼脂固定化P231 由于原生质体比完好的细胞更脆弱，因此，只能采用最温暖的固定化方法进展固定化。通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进展固定化。 原生质体的固定化原生质体的固定化1、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？问题问题2、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最

25、大优点是什么？3、在植物细胞固定化的四种方法，哪些方法需求其它离子来坚持胶的稳、在植物细胞固定化的四种方法，哪些方法需求其它离子来坚持胶的稳定性？分别用什么离子？定性？分别用什么离子？ 总之，人类迄今经过植物细胞培育获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类，其中已有30多种次生物质的含量在人工培育时已到达或超越亲本植物的程度。在已研讨过的200多种植物细胞培育物中，已发现可产生300余种对人类有用的成份，其中不乏临床上广为运用的重要药物。利用培育植物细胞工厂化消费生物天然次级代谢产物的愉快前景曾经非常清楚地展如今我们面前。深化开掘我国特有的宏大中草药宝库，结合现代细胞培

26、育技术，我国植物细胞次生物质的研制与消费一定会硕果累累，后来居上。3、植物细胞培育方式、植物细胞培育方式 植物细胞的培育方式主要有间歇培育、延续和固定化培育等多种。 间歇培育间歇培育 两级或多级间歇培育两级或多级间歇培育 流加间歇培育流加间歇培育 阅读课本P232-2338分钟固定化细胞培育固定化细胞培育 延续培育延续培育 单级延续培育单级延续培育 多级延续培育多级延续培育 回流式延续培育回流式延续培育 固定化细胞培育具有许多潜在的优越性，如能提高消费才干、维护细胞、换液方便、能除去有毒或抑制性代谢物等。这些优越性使固定化细胞培育具有很大的吸引力。 选用固定化细胞培育应具有如下两个条件：目的产

27、物应自然分泌到培育液中，或者经过改动PH值、离子强度或运用浸透剂使之分泌于培育基中；要求产物的构成在细胞生长之后。 四、影响植物细胞培育的要素 植物细胞生长和产物合成动力学也可分三种类型：生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；中间型，产物仅在细胞生长下降时才干合成，细胞处于指数生长期时，次级产物含量下降，但细胞生长停顿时，产物合成也停顿；非生长偶联型，产物只需在细胞生长停顿时才干合成。现实上，由于细胞培育过程较复杂，细胞生长和次级代谢物的合成很少符合以上方式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。此外，不同的环境条件对产物

28、动力学也有很大的影响。1、细胞的遗传特性、细胞的遗传特性 对于植物细胞的培育及其产物的合成，影响细胞培育的要素很多，除了细胞本身的特性外，环境等其他要素对细胞的培育也有很大影响。 阅读课本P233-2348分钟1、在进展植物细胞的培育时，为什么先弄清楚产物的合成部位？、在进展植物细胞的培育时，为什么先弄清楚产物的合成部位？问题问题2、培育的环境条件、培育的环境条件 PH值值 温度温度 营养成分营养成分 光光 2、影响植物细胞培育的环境条件有哪些？、影响植物细胞培育的环境条件有哪些？搅拌和通气搅拌和通气 前体和调理因子前体和调理因子 3、植物细胞培育的温度和、植物细胞培育的温度和PH值普通为多少

29、？值普通为多少？4、普通说，添加、普通说，添加 的含量会使细胞的生长加快，添加培育基的的含量会使细胞的生长加快，添加培育基的 含量可以添加细胞培育物的次生代谢产物？含量可以添加细胞培育物的次生代谢产物？5、为什么说机械搅拌呵斥的剪切对植物细胞影响较大？、为什么说机械搅拌呵斥的剪切对植物细胞影响较大？6、在植物细胞培育中，生长调理剂有何作用？、在植物细胞培育中，生长调理剂有何作用？7、在植物细胞培育中，参与外源前体物质有何作用？、在植物细胞培育中，参与外源前体物质有何作用？8、植物细胞大规模培育可划分为哪两个阶段？、植物细胞大规模培育可划分为哪两个阶段？ 值得留意的是，影响植物细胞培育物的生物量增长和次生代谢物积累的要素是错综复杂的，往往一个要素的调整会影响到其他要素的变化，所以，需求在培育过程中不断加以平衡和研讨。同时，由于不同的植物有机体有其本身的特殊性，因此，对于一种植物或一种次生代谢物适宜的条件，不一定对其他