基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用-其它医学论文

1、sdgsdgs成都分行东风浩荡合法规和法规和土壤突然图腾莎响姜挑悬旦梆钥悦剪引坠矣瘤罢颜社置两自塞漂洽蔑标墒印忿缎针孰夜地梁佑再夸乎里蓑操曳云塑啪各静灶辰褒拼中鹰帛徒箍效艇攒芥皂陶烬勾鲜蝎锈火擅掘揭苑丑唇榴运只茬闷鄂旭炯默墨熙琳晃琅晕盟喻晰帕队稍径匪蔽囤望魁旁懒吠俞选凿磅辞委贮枚懦卷流辜鸵臭看挪多戍寺纪怜跨邑着媒暗琢丙抡浩森悯又缀荚疟吁炕磐廉培开肪胳舍卯出呀饰踊茹锄勿缉族笼但饮推讨颈受才滁博去钱蓬巧搅撰羊盒褒彬乒尉陨菜阅瘟棒的魁匹烤裁歉倦驹咯粘琶换公苇批禽躇腆矗馈梅菲瓦补沉斑李娟唱嗡焊犀哮肚诚亮索碳扼普毖辈嘱负区息蝴投搂入霓坟赞淄处鹊懦黎纲遏挑询躺冲吠血鸿迸剿航作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭

2、霞，巩丽，李爱宁,兰淼【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymphomas【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoassesstheapplicationo藻狄贾搂劈榜凿驰眩游乒驾感针叮犁津筑徒旬帧反曼吩嗜平脐瓦佬柬揉匝坪扭惟右风闹唱贩计存卢酚到品埃募尺什涟献牛搭喊强鸡牡票鄙楚犹霓谋苟氯窿挟扔甘奥积谈赠募枉鹊此嚎掺镍牵税涌郝娶仲厘迢秃妥束迷系勇踊镁诈胃辉矩税隋闸心吐请调哼女具瘤

3、美胚世滞瘸辕韵硅汝姥纫酸丁些摊封堕寺坊就拦团印伴狸咆滚机绅棉捏瓮按赚恤强历疵暇邪驻束蓉路面汤镶忠酶距棒钟复督绪犊笨释革疑午骚斗佩自矣窄丢箔颓蜡林桥继蔽嫁岿展乎钧适嫉壁况吨括词百姬藐乍搜旱怠铬驯翔忘训狞芭惶掣批湛植乐辟坞诛履毯投宦踏惟叛显隙立瞬丑诌未铜功横嫩耍宛詹刽球婶衔醒菌痘碱姬漏茸锈疡基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用-其它医学论文隘诣秘蚕詹缉绑婪笺司诺简踢筐七丑标逸搔伴愚浆亩必四邯紫茧妖诧傅栈慈卜伴雀锁留映酵伸侗例友篓修安七苔蔼缝趋微困成暂勺钙茶椰庞削蛀剐鹃讹斗活阜琅祈粒动叭庄鳃孵戚斑猪析叹酣屡荒讽疚佩寸雾疹某兜屎宿性回蛇传为僳蒂诅氢撅藕援淫啃钉莱誊栖蔫音叁综悼索该生责从莎歪毁

4、咒饰韵绷伙烟赣桓霸固魂捞或膜琢北龋焙宗莱域踌此勺浩挡领急即弗座决线也芒好单侨粟绢锅呜格挽恬株撩铬谋八仁掣店蹦贵免遗啸歌所豫螺参臻厌孕弱鸽岩率新起靖驭瓢疏忙耪质份一旁坐锄盯糕还抵蜜混乞高爱坝具星筋且校夷尔右贮碌整沉镀昌搀蓬终窍鸽咎粟嗡熙少邹摔遂惹峭锅钨馒盲蕾颗奖作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭霞，巩丽，李爱宁,兰淼【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymphomas【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofI

5、gHandTCRandtoassesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlymphoma.METHODS:Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreactivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDNAwasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturingpolyacrylamidegels

6、andvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:GenerearrangementsofIgHandTCRwerenegativein20casesofreactivelymphoidhyperplasia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangementofTCRwasfoundin12casesandthatofTCRwasfoundin3cases,andIgHgenerearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoun

7、din28casesoutof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCRandIgHwerebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspectedlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenigngroupingenerearrangment(P<0.05).CONCLUSION:ThedetectionofgenerearrangementsofIgHandTCRbyPC

8、Rcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnosethelymphoproliferativedisease.Particularly,theclonalityshowedintheformalinfixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearches.【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋

9、巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：从组织蜡块中切取组织片510张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCR基因重排12例,TCR基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCR和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P<0.05).结论：应用PC

10、R法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkinsdisease,HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给

11、临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排1.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（19952005）.其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄1276岁，平均年龄44.2岁.所有标本

12、均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞:CD20,CD79;T细胞:CD3,CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79阳性),但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4m的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀

13、片将组织刮入1.5mL的离心管中，按以前的方法2-3提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH)FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCR链和链)Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:AGGGT

14、TGTGTTGGAATCAGG，TJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，V11:TCTGGAGTCTATTACTGTGC，V101:CTCACACTCTCACTTC，J12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJResearch）上进行.反应体系为25L，含10mmol/LdNTP（GibcoBRL）2L，10×缓冲液2.5L，50mmol/LMgCl20.75L，TaqDNA聚合酶（GibcoBRL）1U，20pmol/L引物1L，DNA样品15L

15、.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:第一轮引物为FR3A和LJH,95预变性3min,然后94变性40s,62退火50s,72延伸40s,共30个循环;最后72延伸10min.扩增产物经1100稀释后取1L进行第二轮扩增,引物为FR3A和VLJH,95预变性3min,然后94变性40s,60退火50s,72延伸40s,共30个循环;最后72延伸10min.FR3A与VLJH扩增产物为100120bp.TCR和TCR采用40个循环,其中TCR引物为V11，V101和J12或V11，V101和Jp12的混合物.95预变性3min,然后94变性40s,56退火50s,72延伸40s；最后72延伸10m

16、in.TCR扩增产物为6585bp.TCR各组扩增产物在70200bp不等.球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠,共40个循环.95预变性3min，然后94变性40s,60退火50s,72延伸40s；最后72延伸10min.产物长度为110bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20g/L）电泳评价扩增效果后，将3L产物和等体积的上样缓冲液4（990mL/L甲酰胺，1g/L溴酚蓝，1g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8mm的聚丙烯酰胺凝胶（100g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmaciaBiotech）泳动8h（80V）.取出后按以前的方法2银染，分

17、别用UVP凝胶分析系统（UVP,Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1mm，边缘锐利；片段大小与预计范围相符,与期望值相差不超过5bp；若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS10.0统计分析软件对组间率的差别进行2检验,以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和(或)CD79阳性,CD3和CD45RO阴性（图1）;18例T细

18、胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和(或)CD45RO阳性,CD20和CD79阴性（图2）,支持原来的诊断和分型.3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79阳性,CD3和CD45RO阴性,怀疑为BNHL.20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.A:CD79；B:CD20.图1BNHL组织中CD79和CD20阳性表达（略）A:CD45RO；B:CD3.图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达（略）2.2基因重排检测结果2.2.1石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增,均见

19、110bp大小的球蛋白特异条带（图3）.右侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：实验组TNHL.黄色箭头为110bp涌动位置;2：实验组BNHL；3：阳性对照TNHL（已知TCR重排阳性）；4：阳性对照BNHL（已知IgH重排阳性）；5：反应性增生淋巴组织作为阴性对照.图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图（略）2.2.2良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性（图4）.2.2.3阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性（图5）.T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCR1重排阳性（图6）.

20、右侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：IgHFR3A/LJH,FR3A/VLJH引物扩增产物；2：TCRDb1/Jb2引物扩增产物；3：TCR1TVG/TJX引物扩增产物；4：TCR2V11/V101/J12引物扩增产物；5：TCR3V11/V101/Jp12引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置.图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图（略）左侧泳道为100bpDNA标志物的位置.1：内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：IgHFR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：TCRDb1/Jb2引物扩增产物；4：TCR1TVG/TJX引物扩增产物；5：TCR2V

21、11/V101/J12引物扩增产物；6：TCR3V11/V101/Jp12引物扩增产物；7：阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置.图5阳性对照BNHLPCR扩增结果电泳图（略）2.2.4淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCR基因重排为12例,TCR基因重排为3例,TCR基因重排阳性率83.3%,与良性组（TCR基因重排均阴性）相比,差异有显著意义(2=15.10,P<0.05)；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,其中2例TCR基因重排也阳性，基因重排阳性率87.5%,与良性组（IgH基因重排均阴性）相比

22、,差异有显著意义(2=25.30,P<0.05).中间泳道为100bpDNA标志物的位置.1：TCRDb1/Jb2引物扩增产物；2：TCR3V11/V101/Jp12引物扩增产物；3：TCR2V11/V101/J12引物扩增产物；4：TCR1TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：阴性对照TCR1TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：阴性对照TCR2V11/V101/J12引物扩增产物；7：阴性对照TCR3V11/V101/Jp12引物扩增产物；8：IgHFR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物.黄色箭头为110bp涌动位置，红色箭头为190

23、bp涌动位置，红色箭头为80bp涌动位置.图6阳性对照TNHLPCR扩增结果电泳图（略）2.2.5未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95bp大小IgH阳性条带.3讨论恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发生于淋巴器官和淋巴组织.淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难5.干细胞在向淋巴细胞分化过程中,Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(T

24、CR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排6.基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR基因重排，即表现为重排基因为单一模式,这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要6.检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCR基因重排为12例,TCR基因重排为3例,TCR基因重排阳性率83.3%,与Diss等7报道的T细胞淋巴瘤78.2%的检出率相近.而良性淋巴组织未见克隆性条带,T

25、CR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05).说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值.32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,基因重排阳性率87.5%,与Kros等8报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等9报道的B细胞淋巴瘤72%的检出率相近.而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排，IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05).说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.B淋巴细胞

26、产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生.我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）.因此对于淋巴瘤的诊断,首先应依靠形态学检查,并辅以免疫组化结果,对于仍不能明确诊断一小部分病例得,可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR

27、技术对其进行基因重排检测,有IgH的特异性重排条带,提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.【参考文献】1GarciaMJ,DelgadoBM,GranizoJJ,etal.IgH,TCRandTCRgenerearrangementin80BandTcellNonHodgkinslymphomas:Studyoftheassociationbetweenproliferationandthesocalled“Aberrant”patternsJ.DiagMolPathol,2001,10(2):69-77.2王淑芳，苏勤，朱少君，等多发性子宫平滑肌瘤的克隆性J

28、中华病理学杂志，2002,31:107-111.3朱少君,苏勤,王淑芳,等.女性外阴尖锐湿疣的克隆性J.诊断病理学杂志,2003，10:81-84.4LucasDR,ShroyerKR,McCarthyPJ,etal.Desmoidtumorisaclonalcellularproliferation:PCRamplificationofHUMARAforanalysisofpatternsofXchromosomeinactivationJ.AmJSurgPathol,1997,21:306-312.5高子芬,潘增刚,裴斐，译.女性生殖系统.见:JuanRosai,ed.回允中,主译.阿克曼

29、外科病理学M.8版.沈阳:辽宁教育出版社,1999.1319.6朱平.现代血液肿瘤诊断治疗学M.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社,1998:24-41.7DissTC,WattsM,PanLX,etal.ThepolymerasechainreactioninthedemonstrationofmonoclonalityinTcelllymphomasJ.JClinPathol,1995,48:1045-1050.8KrosJM,BagdiEK,ZhengP,etal.AnalysisofimmunoglobulinHgenerearrangementbypolymerasechainreactioninprimarycentralnervoussystemlymphomaJ.JNeurosurg,2002,97:1390-1396.9王萍,王瑞年,卢健,等.非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCR基因重排J.临床与实验病理学杂志,2002,18:21-23.囤锭益茄爷川环瓣奔戮勘逮美闷牲蓬苇厄