实验四、PCR基因扩增

1、PCR基因扩增基因扩增 实验四实验四一、实验目的一、实验目的 1）学习掌握PCR反应原理 2）掌握PCR技术的操作过程 3）通过PCR获得银杏黄酮代谢过程中的一个关键酶基因CHS基因（查尔酮异构酶基因）二、二、实验原理实验原理 类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。三、实验试剂、材料、仪器三、实验试剂、材料、仪器 试剂试剂：Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（

2、含MgCl2），dNTP（每种2.5mmol/L）混合物，引物(终浓度各0.5mol/L) ；琼脂糖，50TAE 缓冲液，无菌双蒸水等 材料材料：银杏DNA 仪器仪器：微量移液器，吸头，0.2ml PCR薄壁管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，微波炉等四、操作步骤四、操作步骤 1）取一个干净的PCR薄壁管 2）往PCR管里面加入各种试剂： 2l Primer（ Primer1、2各1l ） 3l DNA模板 15l PCR反应液 10l 无菌ddH2O 30l 3）设定好PCR反应程序如下： 95 4 min 95 50s 57 1.0min 35 cycles 72 2min 72

3、 10 min End 4）开始PCR 5）1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果五、注意事项五、注意事项 ）PCR非常灵敏， 注意移液器的规范使用，保证各种反应试剂吸取的精确性。 ）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染；吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，不要互相污染试剂。 3） PCR的所用试剂应在冰浴上化开，并且要充分混匀 。六、作业 1）将你PCR实验结果的电泳图片附在实验报告上，并根据图片分析你扩增的结果 2）思考：有哪些因素会影响PCR的质量？DNA的结构（的结构（1）三磷酸核糖核苷NTP三磷酸脱氧核糖核苷dNTP三磷酸双脱氧核糖核苷ddNTP补充：补充：PCR 原理原理DNA的

4、结构（的结构（2）A腺嘌呤G鸟嘌呤C胞嘧啶U尿嘧啶T胸腺嘧啶 五种碱基A-T C-GDNA的结构（的结构（3）氢键维持了DNA的双螺旋结构DNA的复制（的复制（1）3-OH进攻5- PiDNA聚合酶催化DNA的延伸方向:5-3DNA的复制（的复制（2） DNA复制相关蛋白在复制起始点打开双链DNA，然后DNA解链酶结合到单链DNA上进一步解开双链DNA DNA的复制（的复制（3）DNA的复制的复制 和和 体外的模拟体外的模拟模板（母链） 细胞内源 外源加入打开双链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反

5、应环境 细胞内环境 缓冲液PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环退火退火PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR整个过程整个过程讨论讨论1：为何酶促反应需要那么高的温度：为何酶促反应需要那么高的温度v为了确保模板是单链，尤其是第一次反应的模板v防止非特异性的引物退火v延伸的温度必须大于退火温度，而小于变性温度 DNADNA聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶聚合酶不能热变性，所以选用耐高温的聚合酶 常规用的PCR DNA聚合酶是从一种嗜热细菌分离出来的DNA聚合酶。酶活性在100 条件下，

6、能保持几个小时。而其最适合酶促温度在72 左右。 讨论讨论2：影响：影响PCR质量的一些因素质量的一些因素模板：选用纯度较高的DNA作模板，杂质蛋白和RNA的存在都会影响到DNA聚合酶与引物和模板的结合。目的片断：目的片断或者目的片断相邻的DNA含GC量较高，或者有重复序列存在，都会导致二级结构的存在。可在反应体系里加入DMSO，破坏模板的二级结构。引物的设计：引物太短，要求退火的温度就低，错配的可能性就大，再者，两条引物不能存在较长的互补片断 。酶：纯度、可信度，碱基错配率1/10000。 讨论讨论3：PCR的应用的应用q从蓝藻里面克隆从蓝藻里面克隆SODSOD(超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶

7、)SOD作用：清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰食品、保健品、药品、化妆品 基因库检索 SOD的序列 设计引物以蓝藻总DNA位模板做PCR获得的基因片断连接在表达载体原核表达蛋白讨论讨论3：PCR的应用的应用q检测粉末样品是否含检测粉末样品是否含有炭疽杆菌有炭疽杆菌 炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球生命力强、传染快、发作快、死亡率高。 有两对引物是根据编码炭疽杆菌EF因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EF因子同源。PCR产物是1247bp和208bp的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。 用营养肉汤培养2小时取培养液直接作PCRPCR技术是现代分子生物学实验技术的一项技术是现代分子生物