基础分子生物学第五讲ppt课件

1、基础分子生物学单元测验 时间 2000 10 9 一、 是非题 1ABC 这三种 DNA 都是有右手螺旋，而 ZDNA 是左手螺旋 ( ) 2在 DNA 的半保留复制过程中，每条 DNA 链都产生岗崎片段 ( ) 3基因就是编码蛋白质的多核苷酸序列 ( ) 4实验室常用 Rnase A 来降价 DNARNA 杂合体中的 RNA 分子 ( ) 二、 简答题 1 为什么高含 GC 的 DNA 序列有较高的 Tm 值？ 2 试论兼并密码子的分子基础。 3.他能用什么样的实验证明模板mRNA只能识别tRNA而不是氨基酸？4.知大肠杆菌DNA总量为4.4x106bp, Cot1/2=9, 有终身物，其C

2、ot1/2=3x10-1，求其细胞中的DNA总量。 三、问答题1 .说说DNA组装成染色体的主要过程。2 .写出肽链合成起始、延伸和终止三个阶段的主要步骤和主要因子。第五讲第五讲 分子生物学研究法分子生物学研究法 一、一、 重组重组 DNADNA 技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件 1.1. 4040 年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是体是 DNADNA 而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；题； 2.502.50 年代提示了年代提示了 DNADNA 分子的双螺旋结构模型和半分子的双螺旋结构模

3、型和半 保留复制机制保留复制机制, ,解决了基因的自我复制和世代交替问题；解决了基因的自我复制和世代交替问题； 3.503.50 年代末至年代末至 6060 年代，相继提出了“中心法则”和操年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说纵子学说, ,成功地破译了遗传密码， 充分认识了遗传信息成功地破译了遗传密码， 充分认识了遗传信息的流动的流动和表达。和表达。 重组重组 DNA 技术历史上的主要事件技术历史上的主要事件 年份年份 事事 件件 1869 F Miescher 首次从莱茵河鲑鱼精子中首次从莱茵河鲑鱼精子中分离分离 DNA。 1944 O.T. Avery 证实证实 DNA 是遗传物质。是

4、遗传物质。 1952 A.D. Hershey 和和 M.Chase再次证实噬再次证实噬菌体的遗传物质是菌体的遗传物质是 DNA。 1953 J.D.Watson 和和 F.H.C.Crick提出提出 DNA分子结构的双螺旋模型。分子结构的双螺旋模型。 M.Wilkins 用用 X-射线衍射法证实了这射线衍射法证实了这一结构。一结构。 1957 A.Kornberg 从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA 聚合酶聚合酶 I。 1958 M. Meselson 和和 F. W. Stahl 证实了证实了DNA 的半保留复制模型。的半保留复制模型。 1959- 1960 S. Ochoa 发现

5、发现 RNA 聚合酶和信使聚合酶和信使RNA， 并证明， 并证明 mRNA 决定了蛋白质分决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg 破译了第一个遗传密码；破译了第一个遗传密码； F. Jacob和和 J. Monod提出了调节基因提出了调节基因表达的操纵子模型。表达的操纵子模型。 1964 C. Yanofsky 和和 S. Brenner 等人证明，等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列核苷酸序列存在着共线性关系。存在着共线性关系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA

6、的的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由“质粒”通常由“质粒”DNA 所决定。所决定。 1966 M.W.Nirenberg，S. Ochoa、H.G. Khorana、F.H.C.Crick 等人破译了全部等人破译了全部遗传密码。遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox 和和 T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。分离了第一种限制性核酸内切酶。 H.M.Temin和和D.Baltimore从从RNA肿瘤肿瘤病毒中发现反转录酶。病毒中发现反转录酶。 1972 - 1973 H.Boyer，P.Berg 等人发展了等人发展了

7、 DNA 重组重组技术，于技术，于 72 年获得第一个重组年获得第一个重组 DNA 分分子，子，73 年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。 1975 - 1977 F.Sanger 与与 A.Maxam、W.Gilbert 等人等人发明了发明了 DNA 序列测定技术。序列测定技术。1977 年完年完成了全长成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组基因组测定。测定。 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程美国联邦最高法院裁定微生物基因工

8、程可以专利化。可以专利化。 1981 R. D. Palmiter 和和 R. L. Brinster 获得获得转基因小鼠；转基因小鼠； A. C. Spradling 和和 G. M. Rubin 得到转基因果蝇。得到转基因果蝇。 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物美、英批准使用第一例基因工程药物胰岛素；胰岛素；Sanger 等人完成了入噬等人完成了入噬菌体菌体 48,502bp 全序列测定。全序列测定。 1983 获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。 1984 斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组 DNA 的专的专利。利。 1986GMO初次在环境中释放。初次在环境

9、中释放。 1988J. D. Watson出任出任“人类基因人类基因组方案首席科学家。组方案首席科学家。 1989DuPont公司获得转肿瘤基公司获得转肿瘤基因小鼠因小鼠“Oncomouse。 1992欧共体欧共体35个实验室结合完成个实验室结合完成酵母第三染色体全序列测定酵母第三染色体全序列测定(315kb)。 1994 第一批基因工程西红柿在美第一批基因工程西红柿在美国上市。国上市。 1996 完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。得克隆羊。 基因工程中常见的名词：基因工程中常见的

10、名词： 遗传工程遗传工程genetic engineering， 基因操作基因操作gone manipulation， 重组重组 DNA 技术技术 recombinant DNA technology， 基因克隆基因克隆gone cloning， 分子克隆分子克隆molecular cloning。 基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤 从生物有机体基因组中，分离出从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的带有目的基因的 DNA 片段。片段。 将带有目的基因的外源将带有目的基因的外源 DNA 片片段连接到能够自我复制的并具有段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重选

11、择记号的载体分子上，形成重组组 DNA 分子。分子。 将重组将重组 DNA 分子转移到适当的分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。之一起增殖。 4 4、从大量的细胞繁衍群体中，挑选出、从大量的细胞繁衍群体中，挑选出获得了重组获得了重组DNADNA分子的受体细胞，并挑分子的受体细胞，并挑选出曾经得到扩增的目的基因。选出曾经得到扩增的目的基因。5 5、将目的基因克隆到表达载体上，导、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需求的实现功能表达，产生出人类所需求的物质。物质。D

12、NA的脉冲电泳技术的脉冲电泳技术PFGE pulse-field gel electrophoresis无规那么ab c aba超大分子，不超大分子，不能有效地被普能有效地被普通电泳所分别。通电泳所分别。a、b表示每次表示每次电泳的不同方电泳的不同方向，向，c为为DNA分子的最终挪分子的最终挪动方向。动方向。运用脉冲电场运用脉冲电场技术，可分别技术，可分别高达高达107bp的的DNA分子。分子。二、二、 基因操作的主要技术原理基因操作的主要技术原理 1 1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 (Agarose (Agarose & Polyacrylamide& Polyacryla

13、mide) ) 将某种分子放到特定的电场将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。电极移动。 某物质在电场作用下的迁移某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等） 。粘度系数等） 。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，基团是离子化的，所以，DNADNA 和和 RNAR

14、NA 实实际上呈多聚阴离子状态（际上呈多聚阴离子状态（PolyanionsPolyanions） 。） 。 将将 DNADNA、RNARNA 放到电场中，它就会由放到电场中，它就会由负极正极移动。负极正极移动。 AgaroseAgarose 的分离范围在的分离范围在 50bp50bp数十数十 kbkb (4.0%) (0.3%) (4.0%) (0.3%) Polyacrylamide(PAGE)Polyacrylamide(PAGE)，1 11000bp1000bp (20%) (4%) (20%) (4%) 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（锭（EB）ethidi

15、um bromide 染染色， 此时， 核酸分子在紫外光下发出色， 此时， 核酸分子在紫外光下发出荧光， 肉眼能看到约荧光， 肉眼能看到约 50ng DNA 所形所形成的条带。成的条带。 D DN NA A的的 脉脉 冲冲 电电 泳泳 技技 术术 ( (P PF FG GE E P Pu ul ls se e- -f fi ie el ld d g ge el l e el le ec ct tr ro op ph ho or re es si is s) ). . 2 核酸的分子杂交技术核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳凝胶电泳 分离的分离的

16、DNA或或RNA分子，分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”动地“吸印” 转移到滤膜上的。常用转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、 硝酸纤维素滤膜，的滤膜有尼龙滤膜、 硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。等。 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹上，这个过程特称

17、为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法 、 斑 点 和 狭 线 印 迹 法法 、 斑 点 和 狭 线 印 迹 法(dot and slot blotting)、 菌落和噬菌斑印迹法、 菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的性标记或其它标记的 DNA 或或 RNA 探针进探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交迹杂交。 3 细菌的转化细菌的转化 所谓细菌转化

18、，是指一种细菌所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的株的 DNA，而导致性状特征发生遗，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化传改变的生命过程。这种提供转化DNA 的菌株叫做供体菌株，而接受的菌株叫做供体菌株，而接受转化转化 DNA 的寄主菌株则称做受体的寄主菌株则称做受体菌株。菌株。 大大肠肠杆杆菌菌是是最最广广泛泛使使用用的的实实验验菌菌株株。在在加加入入转转化化 DNA 之之前前，必必须须预预先先用用 Cacl2 处处理理大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞，使使之之呈呈感感受受态态 （Competent Cells） 。 Mg2+对对

19、维维持持外外源源 DNA 的的稳稳定定性性起起重重要要作作用用，质质粒粒 DNA 中中的的抗抗生生素素是是筛筛选选标标记记。 对对绝绝大大多多数数 hsdR-，hsdM-突突变变体体菌菌株株 （k12） ， 每每 ug DNA 可可得得 107-108个个转转化化子子。 4 DNA 序列分析序列分析 a. Sanger 的双脱氧链终止法的双脱氧链终止法 Cambridge的的F. Sanger在在1977年发明用双脱年发明用双脱氧链终止法测定单链氧链终止法测定单链 DNA 的序列，其基本原的序列，其基本原理如下：理如下： DNA 聚合酶能够用单链聚合酶能够用单链 DNA 作为模板， 合作为模板

20、， 合成准确的成准确的 DNA 互补链；互补链； 该酶能够用该酶能够用 2，3双脱氧核苷三磷酸作双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，末端，从而终止其延伸反应。从而终止其延伸反应。 在在 DNA 测测序序反反应应中中，加加入入模模板板 DNA，引引物物（特特异异性性引引物物，如如 T7，T3，M13 等等） ，DNA 聚聚合合酶酶，dA，dT，dG，dC 和和一一种种 ddNTP。 常常用用 Klenow 大大片片段段，无无 53外外切切酶酶活活性性。 b b MaxamMaxam- -GilbertGilbert 化学修饰法化学修饰法(

21、(哈哈佛大学佛大学) ) 该方法的基本原理是用化学试剂该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的处理具有末端放射性标记的 DNADNA 片片段，造成碱基的特异性切割并产生一段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的组具有不同长度的 DNADNA 链降解产物，链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测可直接读出待测 DNADNA 片段的核苷酸序片段的核苷酸序列。列。 该反应的关键在于使该反应的关键在于使 DNA的的 4种核苷酸中，只有种核苷酸中，只有 1-2 种发生特异种发生特异性的化学切割反应：性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰

22、；碱基的特异性修饰； 被修饰的碱基从核糖环上转被修饰的碱基从核糖环上转移；移； 失去碱基的糖环部位发生失去碱基的糖环部位发生 DNA链断裂。链断裂。 专门用来对核苷酸作化学修饰，专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸 二 甲 酯酸 二 甲 酯 (dimethylsulphate) 和 肼和 肼(hydrazine)。 硫酸二甲酯是碱性化学试剂，硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使能使 DNA 链中鸟嘌呤的链中鸟嘌呤的 N7 和腺嘌和腺嘌呤的呤的 N6 位发生甲基化，在中性位发生甲基化，在中性 PH环境中就能使糖苷键发生水解，并环境中就能使糖苷键发生

23、水解，并引起引起 DNA 链的断裂。链的断裂。 在碱性条件下，肼能特在碱性条件下，肼能特异性切割异性切割 C 和和 T。如果加。如果加入入 1 mol/L 的的 Nacl，那么，那么，只有只有 C 被特异性切割。被特异性切割。 c c D DN NA A 序序列列分分析析自自动动化化 用用四四甲甲基基若若丹丹明明( (T Te et tr ra am me et th hy yl lr rh ho od da am mi in ne e) ) 作作 为为荧荧光光剂剂标标记记 D DN NA A 引引物物，带带有有这这种种引引物物的的 D DN NA A 片片段段能能在在激激光光诱诱导导下下发发

24、出出荧荧光光。按按照照标标准准的的双双脱脱氧氧终终止止法法或或化化学学终终止止法法进进行行测测序序反反应应，跑跑 D DN NA A 凝凝胶胶后后用用计计算算机机检检测测。 d d. .D DN NA A杂杂交交测测序序法法( (S SB BH H- -S Se eq qu ue en nc ci in ng g b by y h hy yb br ri id di iz za at ti io on n) ) 如如果果一一段段较较短短的的 D DN NA A 探探针针能能与与较较长长的的 D DN NA A 片片段段杂杂交交，并并形形成成完完全全的的双双链链结结构构，我我们们就就推推测测在在

25、靶靶 D DN NA A 上上存存在在着着相相应应的的互互补补序序列列，这这就就是是 D DN NA A 杂杂交交测测序序法法的的基基本本原原理理。 如如果果将将一一种种 12-mer 的的靶靶 DNA 与与完完全全随随机机合合成成的的8-mer 寡寡核核苷苷酸酸控控针针混混合合杂杂交交，在在总总数数为为 48=65536种种 8-mer 的的控控针针群群体体中中，仅仅有有 5 种种探探针针会会与与靶靶 DNA杂杂交交，形形成成完完全全互互补补的的双双链链分分子子。 当靶当靶 DNADNA 与标记探针形成与标记探针形成 G G- -T T 或或G G- -A A 末端碱基错配的双链体时，检测末

26、端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显， 较基错配造成的去稳定效应越明显， 较易与完全的双链体分子相区分。易与完全的双链体分子相区分。 但是，探针短，杂交产物的总体但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信稳定性下降，信/ /噪比下降，影响结噪比下降，影响结果的可靠性。所以，果的可靠性。所以，6 6- -mermer 寡核苷酸寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定矩阵芯片只能用于测定 500bp500bp 的靶的靶DNADNA；7 7- -mer=2000bpmer=2000bp，8 8- -mer=8000bpmer=80

27、00bp。 SBH 的应用：的应用： 可有效检测靶可有效检测靶 DNA 中的单碱基突变；中的单碱基突变； 可用于不同可用于不同 DNA 片段之间的序列比较；片段之间的序列比较； 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；定基因的表达状况； 可用于检验传统测序技术的准确性。可用于检验传统测序技术的准确性。 5 基因的定点诱变（基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或使已克隆基因或 DNA片段中的任何片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变

28、，是基因工程的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。和蛋白质工程的重要手段。 a. 盒式诱变盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。种方式。 b 寡寡核核苷苷酸酸引引物物诱诱变变 应应用用化化学学合合成成的的含含有有突突变变碱碱基基的的寡寡核核苷苷酸酸短短片片段段做做引引物物，进进行行 DNA 复复制制，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物成成为为新新合合成成的的 DNA 子子链链的的一一个个部部分分。 CPCRG 与与 PCR 诱诱变变 6 6 利用利用 DNADNA 与蛋白质的相互与

29、蛋白质的相互作用进行核酸研究作用进行核酸研究. . a.a. 凝 胶 滞 缓 实 验凝 胶 滞 缓 实 验 (Gel (Gel retardation assay)retardation assay)，又称，又称 DNADNA迁移率变化试验迁移率变化试验(DNA mobility (DNA mobility shift assayshift assay-EMSA)EMSA)。 b DNase I 印迹试验（印迹试验（DNase I foot printing） 主要步骤：主要步骤： 用用32P标志标志DNA双链末端，双链末端，并用并用RE切去一端；切去一端； 参与细胞特定周期蛋白质提参与细胞特

30、定周期蛋白质提取物，温育；取物，温育； 参与适量参与适量DNaseI或硫酸二甲或硫酸二甲酯酯六氢吡啶，使六氢吡啶，使DNA链发生断裂。链发生断裂。这一反响中，这一反响中，DNaseI或硫酸二甲酯或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！一次断裂！沉淀沉淀 DNA（包括与（包括与 DNA 相结合的蛋白相结合的蛋白质） ；质） ； 进行进行 DNA 凝胶分析。凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与如果某个蛋白质已经与 DNA 的特定区段相的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段结合，那么，它就会保证该区段 DNA 免受免受消化或降解作用。消化或降解作用。

31、在电泳凝胶的放射自显影在电泳凝胶的放射自显影图片上， 相应于蛋白质结合的部位不产生放图片上， 相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。射性标记的条带。 c c 甲基化干扰试验甲基化干扰试验(Methylation (Methylation interference assay)interference assay)。 用用 DMSDMS 处理靶处理靶 DNADNA，使平均每条，使平均每条链上只有一个链上只有一个 G G 被甲基化。将局部被甲基化。将局部甲基化的甲基化的 DNADNA 与含与含 DNADNA 结合蛋白的结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试

32、验。分离各种试验。分离各种 DNADNA 条带，并用六条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。氢吡啶切割甲基化的残基。 假设因某个假设因某个G G残基的甲基化作残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与用而阻止了蛋白质与DNADNA的结的结合，那么，六氢吡啶对这个合，那么，六氢吡啶对这个甲基化甲基化G G残基的切割作用，就残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的只能在没有蛋白质结合的DNADNA中察看到。中察看到。d 体体内内足足迹迹试试验验 用用适适量量 DMS 处处理理完完整整的的游游离离细细胞胞，使使染染色色质质中中的的 G 残残基基甲甲基基化化，提提取取 DNA 并并加加入入六六氢氢吡吡啶啶切切割割

33、 DNA 链链。与与对对照照的的裸裸露露DNA 经经甲甲基基化化处处理理后后形形成成的的梯梯度度相相对对照照，就就能能发发现现 DNA 链链上上的的蛋蛋白白质质结结合合区区。 三三、分子克隆技术、分子克隆技术 1 1、高质量、高质量 mRNAmRNA 的制备的制备 应用应用 Promega PolyAT tract mRNA Promega PolyAT tract mRNA Isolation SystemIsolation System 分离分离 Poly(A)RNAPoly(A)RNA。将将 Biotinylated Oligo(dT)Biotinylated Oligo(dT)引物与细

34、引物与细胞总胞总 RNARNA 共温育，加入与微磁球相连共温育，加入与微磁球相连的的 StreptavidinStreptavidin，用磁场吸附与，用磁场吸附与 PMPPMP相连的相连的 SASA- -Biotinylated Oligo(dT)Biotinylated Oligo(dT)mRNAmRNA。 2 反转录成反转录成 cDNA 可 同 时 在反 转 录系统 中 加 入可 同 时 在反 转 录系统 中 加 入Oligo（dT）12-18-mer 及随机引物及随机引物R6，以保证得到全长，以保证得到全长 cDNA； 应 选 用 活性 较 高的反 转 录 酶应 选 用 活性 较 高的反

35、 转 录 酶（Reverse transcriptase） ；） ； 应选用甲基化应选用甲基化 dCTP； 应保证所获得双链应保证所获得双链 cDNA 的方向的方向性。性。 Super Script Choice cDNA 合成系统中所用合成系统中所用的的 poly（dT）引物）引物 5GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTA GAGA序列序列 GTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3 XhoI Poly(dT) 与与 EcoR I 酶切位点相连的接合序列酶切位点相连的接合序列 5 AATTCGGCACGAG 3 3 GCCGTGCTC 5 因为绝大多数大肠因为绝大多数大

36、肠杆菌细胞都会切除带杆菌细胞都会切除带有有 5-methyl C 的外源的外源DNA，所以，应选用，所以，应选用mcrA- mcrB-菌株。菌株。 3分子克隆的主要方法分子克隆的主要方法 （1）构建）构建 cDNA、核、核 DNA 文库，文库，应用现有核酸探针分离新的目的应用现有核酸探针分离新的目的基因；基因； （2） 差式杂交） 差式杂交(differential screen)和扣除杂交和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；技术； （3）DD-RT-PCR 法及差别显示法及差别显示技术；技术； 4差别分析法差别分析法 (RDA法，即法，即Representa

37、tional difference analysis； 5 酵 母 双 杂 交 体 系 酵 母 双 杂 交 体 系 Tw o -hybrid system；6图位克隆法图位克隆法map-based cloning与染色体步移与染色体步移 genomic DNA Walking。 习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双 生 子从 同 一 受 精 卵 分 裂 而 来 的 单 卵 双 生 子（monozygotic twins

38、）便属于同一克隆。）便属于同一克隆。 细 胞 学 上 ， 克 隆 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞细 胞 学 上 ， 克 隆 是 指 由 同 一 个 祖 细 胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。景的子细胞群体。 分子生物学上， 把将外源分子生物学上， 把将外源 DNA 插入具有自主复插入具有自主复制能力的载体制能力的载体 DNA 中， 使之得以自主复制和永中， 使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。久保存的过程叫做分子克隆。 文文库库筛筛选选与与基基因因丰丰度度有有关关。 高高丰丰度度基基因因，如如蚕蚕丝丝心心蛋蛋白白

39、，卵卵清清蛋蛋白白 等等 在在 某某 些些 特特 定定 组组 织织 中中 可可 占占 细细 胞胞 总总mRNA 量量的的 50-90%，非非常常容容易易被被分分离离。 低低丰丰度度基基因因，一一般般在在细细胞胞中中只只有有 10-20个个拷拷贝贝，哺哺乳乳动动物物细细胞胞中中可可含含 10,000 到到40,000 种种不不同同的的 mRNA，如如果果要要达达到到99% 的的 期期 望望 值值 ， 大大 约约 需需 要要 筛筛 选选150,000-170,000 个个克克隆隆子子。 一一般般情情况况下下，每每微微克克 cDNA 可可产产生生10 万万-60 万万个个克克隆隆子子。 差式杂交或扣

40、差式杂交或扣除杂交克隆技术除杂交克隆技术 cRNA 差式显示法差式显示法 除了极少数特例除了极少数特例(如组如组蛋白基因蛋白基因)之外，几乎所有之外，几乎所有的真核基因的真核基因mRNA分子的分子的3-末端，都带有一段多聚末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所的腺苷酸结构，即通常所说的说的 poly(A)尾巴。尾巴。 P.Liang等人设计合成了全部等人设计合成了全部12种种不同的引物，用以反转录不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链合成第一链cDNA。这种引物通常。这种引物通常叫作叫作3-端锚定脱氧核苷酸引物，端锚定脱氧核苷酸引物，并用并用5-T11MN或或5-T12MN通式通式表示

41、。其中表示。其中M为除了为除了T以外的任何以外的任何一种核苷酸即一种核苷酸即A、G或或C，而，而N那么为任何一种核苷酸即那么为任何一种核苷酸即A、G、C或或T，故，故MN共有共有12种不种不同的陈列组合方式。同的陈列组合方式。 DDRT-PCR 的的主主要要步步骤骤： .从从不不同同发发育育阶阶段段或或不不同同基基因因型型的的细细胞胞群群体体中中分分离离 mRNA，并并以以 3锚锚定定引引物物作作为为反反转转录录的的引引物物， 合合成成第第一一键键 cDNA； .用用 5随随机机引引物物和和某某个个 3端端锚锚定定引引 物物对对扩扩增增第第一一链链(掺掺入入 32p-dNTP)； .用用 DN

42、A 变变性性测测序序胶胶分分离离扩扩增增产产物物，X 光光片片曝曝光光后后检检测测差差别别条条带带； .回收特异性差别条带；回收特异性差别条带； . .用同一引物对扩增已回用同一引物对扩增已回收的收的 DNADNA 条带；条带； . .用用 Northern，Southern及测序法分析所得的条带；及测序法分析所得的条带； . .以该以该 DNA 片段做探针，片段做探针，筛选全长筛选全长 cDNA 或核基因。或核基因。 c cD DN NA A差差式式分分析析法法( (R Re ep pr re es se en nt ta at ti io on na al l d di if ff fe

43、er re en nc ce e a an na al ly ys si is s) ) R RD DA A 法法充充分分发发挥挥了了 P PC CR R 以以指指数数形形式式扩扩增增双双链链 D DN NA A 模模板板的的特特性性，通通过过降降低低 c cD DN NA A 群群体体复复杂杂性性和和更更换换 c cD DN NA A 两两端端接接头头等等方方法法， 特特异异扩扩增增了了目目的的基基因因片片段段。 由于实验对象由于实验对象TesterTester和和供试探针供试探针DriverDriver在接受在接受差式分析前均经一个差式分析前均经一个4 4碱基切碱基切割酶处置，构成平均长度

44、割酶处置，构成平均长度256bp256bp的代表群的代表群representationrepresentation保证绝保证绝大部分遗传信息能被扩增。大部分遗传信息能被扩增。 每次每次 T减减 D反应后仅反应后仅设置设置 72复性与延伸，复性与延伸，94复性这两个参数共复性这两个参数共20 个个 PCR 循环，循环，PCR产物的特异性和所得探产物的特异性和所得探针的纯度非常高。针的纯度非常高。 mRNAcDNA4 碱基内 切 酶消化加 12/14碱基接 头分 开12碱基 短链PCR填充材 料实 验 材料去 除 原有 接 头 , 连 上新 接 头去 除原有 接 头1:100混合 , 变性 , 杂

45、 交线性 扩 增指数扩 增无扩 增1 差异 产 物 酵母双杂交体系酵母双杂交体系 Two-hybrid system 也叫也叫interaction trap（相互作用（相互作用陷井） ，是陷井） ，是 90 年代初发展起年代初发展起来的分离基因的新方法，可来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用）相互作用的基因。的基因。 基本原理：基本原理： 真核生物的转录因子大多是由真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如构域组成的。如 GAL4 的的 N 端端1-147aa

46、 是是 DNA 结合域（结合域（BD） ，其） ，其C 端端 768-881aa 是 转 录激活域是 转 录激活域（AD） 。一般情况下，） 。一般情况下，AD 能与能与GAL4 效应基因启动子上游的特定效应基因启动子上游的特定DNA 区段 （区段 （UAS） 相结合， 而此时，） 相结合， 而此时，AD 则推动了转录起始。则推动了转录起始。 若用基因工程的方法， 将若用基因工程的方法， 将GAL4 ADGAL4 AD 和和 BDBD 分别克隆到分别克隆到不同的载体上，导入同一不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因细胞株中表达，效应基因无法被激活无法被激活, ,但可把来自但可把来自不同转录因子的不同转录因子的 ADAD 或或 BDBD区域连成一个功能基因。区域连成一个功能基因。 主主要要实实验验过过程程： a. 选选择择缺缺失失 GAL4编编码码基基因因的的酵酵母母寄寄主主菌菌