内源性活性物质ppt课件

1、体内药物分析内源性活性物质的分析王伟王伟;内源性活性物质1、定义内源性生物活性物质是指人类和哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物学活性的物质，它们可以是小分子化学物质，也能够是糖类、生物活性肽类、核苷和核酸、生长因子、内源性调理因子、细胞因子和蛋白质等。2、研讨意义 许多艰苦的突破都是由于发现了体内那些具有重要生理活性的物质，并发现调理这些物质的其它相关物质。基因克隆使“ 受体一指点 和 “ 酶一指点 的新药的发如今方法学上得到完善。D NA 重组和转基因技术的开展已使蛋白质和肽类药物的消费及其它内源性分子作为新药成为能够。;蛋白质类内源性活性物质的分析;Western Blot West

2、ern Blot中文普通称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其根本原理是经过特异性抗体对凝胶电泳处置过的细胞或生物组织样品进展着色。经过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。;荧光探针定义： 与蛋白质、核酸(DNA或RNA)或其他大分子构造非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改动的小分子物质。可用于研讨大分子物质的性质和行为。 ;荧光探针 荧光探针除运用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的运用。 可以分为荧光素类探针、无机离子荧光探针、荧光量

3、子点、分子信标几类;与G G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形状的影响;免疫组织化学法 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标志的特异性抗体在组织细胞原位经过抗原抗体反响和组织化学的呈色反响，对相应抗原进展定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反响的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞程度检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 免疫化学技术近年来得到迅速开展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐开展建立起高度敏感，且更为适用的免疫酶技术。;免疫组织化学染色法

4、 免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专注性的结合反响，检测细胞或组织中能否有目的抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可察看抗原所表现的位置。只需是可以让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。 ;免疫组织化学染色法 免疫组织化学的优势在于专注性、灵敏度、简便快速以及本钱低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标志来挑选癌症。免疫组织化学染色法对根底研讨及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。;发光免疫测定luminescence immunoassay;LIA;luminescent im

5、munoassay 将发光系统与免疫反响相结合，用于检测抗原或抗体的技术。 以发光物质标志抗原或抗体，免疫反响后引发发光反响，根据发光强度对抗体或抗原进展的测定。 ;层析 chromatography 基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分别的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相挪动的速度不同而分别。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。 层析是运用蛋白质的等电点不同而分析分别蛋白质的。;双向凝胶电泳双向凝胶电泳2D2D胶电泳的根本原理胶电泳的根本原理先将蛋白质根据其等电点在先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯

6、度胶内进展等电聚焦，然后按照它们的梯度胶内进展等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进展相对分子质量大小进展 SDS-PAGE 第二次电泳分别。第二次电泳分别。第一向进展等电聚焦第一向进展等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进展电泳时，会向与其所梯度介质上进展电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向挪动。挪动过程中，蛋白分子能够获得或失去质子，并带电荷相反的电极方向挪动。挪动过程中，蛋白分子能够获得或失去质子，并随着挪动的进展，该蛋白所带的电

7、荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电随着挪动的进展，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再挪动。当蛋白分散到低于其等位置时，其净电荷数为零，在电场中不再挪动。当蛋白分散到低于其等电点电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极挪动。同样，假设蛋区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极挪动。同样，假设蛋白质分散到高于其等电点的白质分散到高于其等电点的 pH 区域时，那么带负电，在电场的作用下会向阳区域时，那么带负电，在电场的作用下会向阳极挪动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的极挪动。根据各自不同的等电点

8、，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介梯度介质区域内。目前常运用预制胶条质区域内。目前常运用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的用于蛋白质的等电聚焦分别，将聚焦好的等电聚焦分别，将聚焦好的 IPG 胶条在含有胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。的缓冲液中平衡。第二向是将在第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分别的蛋白质转移到胶条中经过第一向分别的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分别。沿大小与第一向相垂直的分别。沿垂直的方向进展垂直的方向进展

9、 SDS-PAGE电泳聚丙烯酰氨凝胶电泳，按分子量大小进展电泳聚丙烯酰氨凝胶电泳，按分子量大小进展分别。样品经过电荷和质量两次分别后，得到等电点和分子量的信息。分别。样品经过电荷和质量两次分别后，得到等电点和分子量的信息。 ;IPG 胶的资料是胶的资料是 Immobilines，为拥有，为拥有CH2=CH-CO-NH-R构造的构造的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在基或叔氨基团，它们构成了分布在pH 310不同值的不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试试剂添加至混合物中用于

10、凝胶聚合，在聚合中缓冲基团剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团经过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而构成经过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而构成pH梯度。经过这种方式生成的梯度。经过这种方式生成的IPG不会发生电浸透作用，不会发生电浸透作用，因此可以进展特别稳定的因此可以进展特别稳定的IEF分别到达真正的平衡形分别到达真正的平衡形状。状。;2D胶电泳数据库;细胞因子的测定ELISAELISA系列的试剂盒 细胞因子绝大部分是蛋白质，并且普通都用ELISA试剂盒测定。;ELISA法酶联免疫吸附剂测定是主要的测蛋白的方法;ELISA 的原理ELISAELISA是以免疫学反响为根底，将抗原

11、、抗是以免疫学反响为根底，将抗原、抗体的特异性反响与酶对底物的高效催化作体的特异性反响与酶对底物的高效催化作用相结合的一种用相结合的一种 敏感性很高的实验技术。敏感性很高的实验技术。;根底根底: :抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标志。结合在固相载体外表的抗原或抗酶标志。结合在固相载体外表的抗原或抗体仍坚持其免疫学活性，酶标志的抗原或体仍坚持其免疫学活性，酶标志的抗原或抗体既保管其免疫学活性，又保管其酶的抗体既保管其免疫学活性，又保管其酶的活性。活性。;测定时，受检标本与固相载体外表的抗原测定时，受检标本与固相载体外表的抗原或抗体起反响，洗涤参与酶标志抗原或抗

12、或抗体起反响，洗涤参与酶标志抗原或抗体，参与酶反响的底物后，底物被酶催化体，参与酶反响的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进展定性或定量分质的量直接相关，由此进展定性或定量分析。析。;免疫测定在临床检验中的运用的可行性免疫测定在临床检验中的运用的可行性由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，尤其采用基因工程方法制备包

13、被抗原来检测样尤其采用基因工程方法制备包被抗原来检测样本中的相应抗体，都大大提高了本中的相应抗体，都大大提高了ELISAELISA的特异的特异性，加之电脑化程度极高的性，加之电脑化程度极高的ELISAELISA检测仪的运检测仪的运用，使用，使ELISAELISA更为简便适用和规范化，从而使更为简便适用和规范化，从而使其成为最广泛运用的检测方法之一。其成为最广泛运用的检测方法之一。;综上，由于综上，由于ELISAELISA具有快速、敏感、简便、具有快速、敏感、简便、易于规范化等优点，使其得到迅速的开展易于规范化等优点，使其得到迅速的开展和广泛运用和广泛运用 。;举例：多糖蛋白的检测ELISA试剂

14、盒法 CRP，肺炎球菌细胞壁c多糖蛋白，一种急性时相期蛋白，亦称C反响蛋白，正常参考值10mg/L。本身由肝细胞产生能结合肺炎球菌细胞壁糖蛋白，能监测疾病的开展情况为非特异性的检验目的，很多疾病时都可以表现出来。;RIA法儿 放射免疫测定/放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA) ;RIA法根本原理： 在放射免疫分析的实验中，参与超量的标志抗原*Ag与未标志抗原Ag即：待测抗原与较少量的抗体Ab竞争性结合。 假照实验结果所计量到的结合物*Ag-Ab放射活性较高，表示待测物的浓度较低。 假设所计量到的结合物放射活性较低，那么表示待测物的浓度较高。 藉由规范 曲线图的分析，可以推算

15、出待测物的浓度。 ;用 ELISA 法及 RIA 法检测;活性蛋白及其降解产物的测定;血浆纤维蛋白原程度与纤维蛋白 体聚合功能的测定;血浆纤维蛋白原降解产物测定血浆纤维蛋白原降解产物测定参考值 5mg/L 意 义 1.增高见于原发性纤溶症,DIC(弥散性血管内凝血),恶性肿瘤,肝脏疾病,肾脏疾病,肺梗死,白血病,器官移植的排斥反响等.;血浆纤维蛋白原降解产物测定血浆纤维蛋白原降解产物测定原理 将FDPs单抗色酸干酶标板,参与受检血清,血清中FDPs(抗原)与包被在反响板的FDPs单抗结合,然后再参与酶标志的FDPs抗体,与包被的FDPs结合,最后参与底物显色,显色深浅与血清中FDPs含量成正相

16、关,所得的A值可从规范曲线中计算出血清中FDPs的含量.;炎症细胞因子在众多炎症细胞因子中，起主要作用的是TNF- 、IL-1、IL-6、TGF-、IL-8、IL-l0等。 TNF-是炎症反响过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，使血管内皮细胞通透性添加，调理其他组织代谢活性并促使其他细胞因子的合成和释放。 IL一6能诱导B细胞分化和产生抗体，并诱导T细胞活化增殖、分化，参与机体的免疫应对，是炎性反响的促发剂。 IL-8能刺激中性粒细胞、T淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的趋化，促进中性粒细胞脱颗粒，释放弹性蛋白酶，损伤内皮细胞，使微循环血流淤滞，组织坏死，呵斥器官功能损伤。 ;

17、生物活性法儿测定验证因子详细举例白介素-2(17到24张);本法系根据在不同白介素本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)-2 (IL-2)的的浓度下，其细胞依赖株浓度下，其细胞依赖株CTLL-2CTLL-2细胞存活细胞存活率不同，以此检测率不同，以此检测IL-2IL-2的生物学活性。的生物学活性。 ;试剂试剂(1) RPMI1640(1) RPMI1640培育液培育液 取取RPMI 1640RPMI 1640培育培育基粉末基粉末1 1袋袋( (规格为规格为1L)1L)，加水溶解并稀释至，加水溶解并稀释至1000ml1000ml，加青霉素，加青霉素105IU105IU和链霉素和链霉素105 I

18、U105 IU，再加碳酸氢钠再加碳酸氢钠2.1g2.1g，溶解后，混匀，除菌，溶解后，混匀，除菌过滤，过滤，44保管。保管。(2) (2) 根底培育液根底培育液 取新生牛血清取新生牛血清(FBS)(FBS) 10ml 10ml，加，加 RPMl 1640 RPMl 1640培育液培育液90ml90ml。44保保管。管。(3)(3)完全培育液完全培育液 取根底培育液取根底培育液100ml100ml，加重组人自介素加重组人自介素-2-2至终浓度至终浓度400400800IU800IU。44保管。保管。;(4) PBS (4) PBS 取氯化钠取氯化钠8.0g8.0g、氯化钾、氯化钾0.20g0.2

19、0g、磷酸氢二钠磷酸氢二钠1.44g1.44g、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾0.24g0.24g，加，加水溶解并稀释至水溶解并稀释至1000ml1000ml，经，经121 15121 15分钟分钟灭菌。灭菌。(5)(5)噻唑蓝噻唑蓝(MTT)(MTT)溶液溶液 取取MTT 0.1gMTT 0.1g，加，加PBSPBS溶解并稀释成溶解并稀释成20ml20ml，经，经0.22pm0.22pm滤膜过滤滤膜过滤除菌。除菌。44避光保管。避光保管。(6)(6)裂解液裂解液 15 15十二烷基硫酸钠溶液，十二烷基硫酸钠溶液，运用期限不得超越运用期限不得超越1212个月。个月。CTLL-2CTLL-2细胞细胞 应

20、为偏酸性、略微浑浊液应为偏酸性、略微浑浊液体，传代后体，传代后48486060小时用于重组人白介素小时用于重组人白介素- -2 2生物学活性测定。生物学活性测定。 ;规范品溶液的制备规范品溶液的制备 取重组人白介素取重组人白介素-2-2生物学活性测定的国家规范品，按运用阐生物学活性测定的国家规范品，按运用阐明书复溶后，用根底培育液稀释至每明书复溶后，用根底培育液稀释至每lmllml含含200IU200IU。在。在9696孔细胞培育板中，做孔细胞培育板中，做2 2倍系倍系列稀释，共列稀释，共8 8个稀释度，每个稀释度做个稀释度，每个稀释度做2 2个个孔。每孔分别留孔。每孔分别留50ul50ul规

21、范品溶液，弃去孔规范品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进展。中多余溶液。以上操作在无菌条件下进展。 ;供试品溶液的制备供试品溶液的制备 将供试品按标示将供试品按标示量复溶后，用根底培育液稀释成每量复溶后，用根底培育液稀释成每lmllml约约含含200IU200IU。在。在9696孔细胞培育板中。做孔细胞培育板中。做2 2倍倍系列稀释，共系列稀释，共8 8个稀释度，每个稀释度做个稀释度，每个稀释度做2 2孔。每孔分别留孔。每孔分别留50ul50ul供试品溶液，弃去供试品溶液，弃去孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下孔中多余溶液。以上操作在无菌条件下进展。进展。 ;测定法测定法 CTLL

22、-2 CTLL-2细胞用完全培育液于细胞用完全培育液于3737、5%5%二氧化碳条件下培育至足够量，二氧化碳条件下培育至足够量，离心搜集离心搜集CTLL-2CTLL-2细胞，用细胞，用 RPMI 1640 RPMI 1640培培育液洗涤育液洗涤3 3次，然后重悬于根底培育液中次，然后重悬于根底培育液中配制成每配制成每lmllml含含6.O6.O105105个细胞的细胞悬个细胞的细胞悬液，置液，置3737、5 5二氧化碳条件下备用。二氧化碳条件下备用。在加有规范品溶液和供试品溶液的在加有规范品溶液和供试品溶液的9696孔孔细胞培育板中，每孔参与细胞悬液细胞培育板中，每孔参与细胞悬液50ul50ul，于于3737、5 5二氧化碳培育二氧化碳培育18182424小时。小时。 ;然后每孔参与然后每孔参与 MTT MTT溶液溶液20ul20ul，于，于3737、5 5二氧化碳培育二氧化碳培育4 46 6小时后，每孔参与裂小时后，每孔参与裂解液解液150ul150ul，于，于3737、5 5二氧化碳条件下二氧化碳条件下保温保温18182424小时。以上操作均在无菌条件小时。以上操作均在无菌条件下进展。混匀细胞板中的液体，放入酶标下进展。混匀细胞板中的液体，放入酶标