甲胎蛋白基因在转录水平上的检测ppt课件

1、 检测甲胎蛋白基因在转检测甲胎蛋白基因在转录水平上的的表达情况录水平上的的表达情况1 1 讨论的题目 甲胎蛋白基因(alpha-fetoprotein，AFP) (GenBank 登录号: NM_001134.1)的异常表达与肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤有关，请根据基因表达的检测方法，设计实验方案从转录水平检测AFP的表达情况。实验方案包括：实验目的、实验方法及原理、技术路线、可能的结果分析及应用等。2 2 1、掌握Northern印迹杂交和RTPCR技术的方法2、了解实验的操作方法和步骤3、判断基因在转录水平的表达情况3 3甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)甲胎蛋白是肿瘤相关

2、的胚胎特异-球蛋白,分子量约为70kDa，是一直以来都被认为是临床诊断胎儿出生缺陷和肝细胞癌的经典肿瘤标志物。正常情况下这种存在于胚胎早期血清中的甲胎蛋白在出生后就迅速消失，如果重现于成人血清中则提示有肝癌的可能。 4 4AFP基因的DNA结构 AFP基因约为20kbp大小,由15个内含子和14个外显子组成,包含590个氨基酸,其中在N末端有19个氨基酸是信号肽序列。5 5实验方法 1、 Northern印记杂交 2、核糖核酸酶保护试验 3、原位杂交 4、RTPCR技术 5、实时荧光定量PCR6 6Northern印迹杂交实验原理 Northern印迹杂交是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移

3、到固相支持物上，然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA 分子的含量及其大小的过程。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。7 7实验技术路线1、提取mRNA2、琼脂糖凝胶电泳分离RNA3、Northern印迹转移前的凝胶预处理4、Northern印迹转移5、用标记的RNA探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交6、杂交结果的显示8 8结果分析 1、若出现明显杂交带，则表明细胞组织内有AFP基因的表达，则会有患肝癌的风险。2、若没有出现明显杂交带，则表明细胞组织内基因未表达。9 9应用 Northern印

4、记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。1010RT-PCR技术实验原理 逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板经反转录酶或随机引物的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段检测基因表达。1111试验技术路线 1、提取mRNA 2、反转录DNA链 3、PCR扩增 4、凝胶电泳 5、结果显示1212反转录酶的选择 1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶 2 禽

5、成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶。 4MMLV反转录酶的RNase H突变体1313引物设计的原则 1、长度及碱基分布 2、引物之间及引物自身 3、引物3端 4、引物5端 5、二级结构区 6、简并引物1414结果分析 1、若有AFP基因表达，则在与其反转录CDNA链分子量平行处应有检测信号。 2、若AFP基因未表达，则在与其反转录CDNA链分子量平行处没有检测信号。1515应用 1、分析基因的表达 2、获取目的基因 3、合成CDNA探针 1616Northern印迹杂交与PCR方法的比较 Northern印迹杂交技术检测mRNA表达水平的敏感性较PCR技术低，但其特异性强，假阳性率低，