蜡梅凝集素基因Cplectin在百合中的表达及抗虫性初步鉴定

1、蜡梅凝集素基因Cplectin在百合中的表达及抗虫性初步鉴定本文以麝香百合（ Lilium longiflorum Tbunb）“素雅”（ White-Elegance ）和“晶体”（ Gelria ）作为供试材料 , 通过外植体的再生 , 抗生素筛选条件及农杆菌介导遗传转化条件的优化, 建立了百合的高频再生及遗传转化体系。用农杆菌介导法将蜡梅凝集素基因Cplectin转入百合中 , 并对转化植株进行了抗虫实验,主要研究结果如下 :1. 高频再生体系的建立（ 1）“素雅”鳞茎片的诱导分化培养基为 MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L,分化率为 91.7%; 再生苗鳞茎片的不定芽分

2、化培养基为 MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L,分化率为 90%;再生苗叶柄的诱导培养基为 MS+NAA1mg/L,分化率为 77.5%; 生根培养基为 1/2MS+NAA0.05 mg/L。（2）“晶体”鳞茎片的诱导分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L,分化率为 88.3%;愈伤组织的分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂 6g/L, 分化率为 250%;胚性保持培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂 6g/L; 再生苗鳞茎片的不定芽分化培养基为 MS+6

3、-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L,分化率为 87.5%; 生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg/L。2. 遗传转化体系的建立（ 1）受体材料选择对于“素雅”这一品种再生苗鳞茎片和小叶柄分化率都比较高, 但鳞茎片的组织对农杆菌的耐受能力强 , 且分化能力强 , 所以得到的抗性芽率高, 而转化受体假阳性率也比较高,会增加后期检测的工作量; 而再生苗叶柄的再生能力也比较强, 且取材方便 , 多数直接能分化出幼苗 , 能够降低变异的发生频率, 所以选择“素雅”再生苗叶柄作为受体材料。对于“晶体”这一品种来说, 在鳞片再生过程中产生大量的疏松的浅黄色的胚性愈伤组织 , 多次继代后 ,

4、仍保持良好的胚性及较强的生命力, 接入分化培养基中能顺利分化出再生小植株。这对于遗传转化是非常有利的, 所以选择“晶体”胚性愈伤组织作为受体材料。（2）抗生素浓度的确定根据卡那霉素（Kan）抗性筛选试验 , 确定了受体材料适宜的筛选浓度 , 以“素雅”的再生苗叶柄为受体材料, 当卡那霉素的浓度为100mg/L 时 , 叶柄的褐变率为97.5%, 为亚致死浓度 , 所以 Kan100mg/L适合作为叶柄的抗性筛选压 ; 同理 , 以“晶体”的愈伤组织为受体材料时, 当卡那霉素浓度为75mg/L时 , 愈伤组织褐变率为95%,所以 Kan75mg/L适合作为愈伤组织的抗性筛选压。在生根培养基中 ,

5、 当 Kan 浓度为 150mg/L 时 , 以上两个品种的再生苗叶全部变黄 , 没有根生成 , 所以选用 Kan150mg/L作为转化植株生根的筛选浓度。根据头孢霉素（ Cef）抑菌试验 , 在头孢霉素浓度为 250mg/L 时, 以上受体材料均有很好的抑菌效果 , 且不影响受体生长 , 所以选择为 250mg/L 作为抑菌浓度。（ 3）遗传转化条件的研究本试验对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行了研究 , 结果发现 : 取“素雅”的再生苗叶柄作为受体材料 , 预培养 2d 后 , 在OD₆₀₀值为 0.6-0.8的农杆菌菌液的 MS（无NH&

6、lt;sub>4</sub>NO₃）重悬液中侵染 10-12min, 再共培养 3d, 可获得的较高瞬时表达率 , 为 41.6%;“晶体”愈伤组织作为受体时, 将经过 2-3min 创伤处理的愈伤组织 , 放在 OD₆₀₀值为 0.6-0.8的农杆菌菌液的MS重悬液中侵染 8-10min 。共培养 3d, 瞬时表达率较高 , 为 43.3%。在以上研究的基础上 , 进一步研究发现 , 两种受体材料 , 在离心重悬的 MS液（无 NH₄NO₃）中加入 100 mol/L 乙酰丁香酮 , 在共培养基中也加入 100 mol/L 乙酰丁香酮时 ,瞬时表达率较不添加乙酰丁香酮时有大幅度提高。分别从 41.6%和 43.3%, 提高到 71.6%和 75.0%。3. 转化植株的获得通过筛选培养 , 获得卡那霉素抗性植株 , 对“素雅” 86 株抗性株和“晶体” 93 株抗性株进行 GUS染色和 PCR检测 , 初步鉴定凝集素基因Cplectin已经整合到两种百合中 ,其中各有 2