植物DNA提取方法

1、1.2实验方法1.2.1 茶花基因组DNA的提取采用CTAB法8提取DNA，所有试剂(有机溶剂除外)和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下：(1) 取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性 的糊状或粥状，转入 1.5ml的离心管中，于 65 C水浴锅中保温约 60min.(2) 待混合物冷却至室温后加入等 600ul的CI (氯仿：异戊醇=24 : 1)溶液混匀，轻轻颠倒 离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。(3

2、) 重复步骤(2) 一次。(4) 取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA4C, 12000rpm 离心 10min.弃去上层有机溶剂，加500UI75%乙醇洗涤沉淀，4 C下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。(6 )倒置或者37度培养箱烘干.加50UITE缓冲液溶解DNA，于-20 C冷藏备用。1.2.2 DNA含量和质量的测定(1) 紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的 DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出 OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。

3、(2) 琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在 0.5X TBE缓冲液中，电压 5V/cm电泳约 60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。1.2.3 PCR 扩增(1)PCR 反应在 Biometro PCR 仪上进行，反应体系为 25ul:ddH 2O 14ul,10 x Buffer 2.5ul,MgCI(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约40-60ng),Taq 酶(5U/ul ) 0.3ul.ddH2O13.7uL10x buffer2.5 uLdNTPs2.0 uLM

4、gCl2Primer2.0 uLDNA2.7 uL (40-60ng)Taq酶0.3 uL2.5 uL共 25 uL 反应程序为：94C预变性3min;94 C变性30s,36 C退火1min,72 C延伸1min30s,40次循环；72 C最终延伸10min;4 C保存。预变性94 C3 min变性94 C30 s退火36 C1min”40个循环延伸72 C1mi n30s丿继续延伸72 C10 min保存4 C1.2.4 PCR扩增产物检测取扩增产物与6 x loading buffer混匀，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，缓冲液为0.5 x TBE,电压5V/cm,电泳1.5-2h.经溴化

5、乙锭染色20min后,取出凝胶在成像系统中拍照并保存结果。1.3数据处理及RAP酎析得出清晰，亮度较好的条带后，用laberworkers软件分析所得条带，在同一位点重复出现条带的记为“ 1 ”（包括弱带），不出现条带的记为“ 0” 9，并分析扩增条带的长度。将生成 的数据输入电子表格，用 NTSYSpc21软件分析得出据类图和遗传相似系数和遗传距离。其 中相似系数10为：s= 2M xy/（M x + M y ） x 100% （s表示相似系数,M xy表示品种x、y共 有片段总和，M x表示x品种片段数，M y表示y品种片段数）,遗传距离D=1 -F。2结果与分析2.1基因组DNA提取提取

6、的DNA经分光光度计测定，其 OD260/280 ,DNA含量如下:表2 基因组 DNAOD/280 ,DNA含量。Table2 Results of DNA extraction from leaves of 15 Camellia samples茶花品种OD260/280Camellia speciesDNA含量 ug/mlDNA content杜鹃茶（Dujuancha）1.85凹脉(Ao' mai)1.45金丝玉蝶（Jinsiyudie)1.43连蕊茶(Lianruicha )1.45六角白(Liujiaobai)1.81玉美人（Yumeiren）1.34醉杨妃(Zuiyang

7、fei )1.43凤仙(Fengxian)1.35酒中花(Jiuzhonghua)1.33孩儿面(Haiermian)1.59墨光镜(Moguangjing)1.38红露珍(Hongluzhen)1.45秋牡丹（Qiumudan）1.41公正评奖团1.39星上星(Xingshangxing)1.320.7082.6181.2825.8371.0941.1241.8071.5371.1655.4011.3950.9652.7923.5460.857RAPD扩增的要求。基因组DNA OD 260/280在1.32-1.85之间，符合附录2:所用试剂及配方4% CTAB（十二烷基三甲基溴化胺 ）1mol/L EDTA （乙二胺四乙酸二钠）1mol/L Tris-HCl4.2mol/L NaCl3mol/L NaAC称取10gCTAB，加水定容至250ml.称取 EDTA 37.224g，用 NaOH（固体）调 PH至8.0，最后定容至100ml.称取12.114g Tris-HCl ，用80ml蒸馏水溶解,加浓HCI，最后定容至100ml.称取 NaCl 61.362g,定容至 250ml称取 NaAC 4.824g，定容至 100ml5X TBETris-HCl :54g硼酸：27.5gEDTA :10mol/L定容带1L2% CTAB缓冲液TE缓冲液4%