细胞悬浮培养

1、 是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细是指将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。 这种培养方法能提供同步分裂的、增殖迅速的大这种培养方法能提供同步分裂的、增殖迅速的大量细胞，可用于大规模的工业化生产。量细胞，可用于大规模的工业化生产。细胞悬浮培养（细胞悬浮培养（cell suspension culture）5.1悬浮培养的方法 分批培养分批培养连续培养连续培养 是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培

2、养物。养物。（一）分批培养(batch culture) 在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止即行停止。 分批培养的特点一般是一般是100100250 ml250 ml三角瓶，三角瓶，每瓶中装有每瓶中装有202075 ml75 ml培养培养基。基。分批培养所用的容器分批培养所用的容器 为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法

3、是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释培养基中（大约稀释5 5倍）。倍）。 如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。静止期的时候，须尽快进行继代。提高细胞分散程度的方法提高细胞分散程度的方法1. 尽可能使用易散碎的愈伤组织尽可能使用易散碎的愈伤组织 愈伤组织的结构是受遗传因子控制的，

4、因而愈伤组织的结构是受遗传因子控制的，因而有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。有时无论采用什么办法也难于使细胞充分分散。不过，一般来说，不过，一般来说，如果培养基的成分和继代方法如果培养基的成分和继代方法选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。选用得当，总有可能提高细胞的分散程度。如果把愈伤组织在半固体培养基上保存如果把愈伤组织在半固体培养基上保存2-3个继代周期，个继代周期，其松散性常会增加。其松散性常会增加。 已知加入已知加入2, 4-D2, 4-D，少量水解酶（如纤维，少量水解酶（如纤维素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的素酶和果胶酶），或加入酵母浸出液一类的物质，都能促进细胞的分

5、散。物质，都能促进细胞的分散。2. 加入特殊物质加入特殊物质 如果每隔如果每隔1d加一次新鲜培养基，使生物量加一次新鲜培养基，使生物量与培养基容积之比保持为与培养基容积之比保持为2，这样，悬浮培养，这样，悬浮培养细胞即可长期保持在对数生长晚期，于是就有细胞即可长期保持在对数生长晚期，于是就有可能使细胞最大程度分散。可能使细胞最大程度分散。 3.3.加新鲜培养基加新鲜培养基 4.选择单细胞和小细胞团进行继代选择单细胞和小细胞团进行继代 但是必须记住，但是必须记住，即使在分散程度最好的悬浮液即使在分散程度最好的悬浮液中也存在着细胞团中也存在着细胞团，每个细胞团由几个或几十，每个细胞团由几个或几十个

6、细胞组成，个细胞组成，只含有游离细胞的悬浮液是没有只含有游离细胞的悬浮液是没有的的。这是因为植物细胞具有。这是因为植物细胞具有集聚在一起的特性集聚在一起的特性，由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞，由一个初始细胞经过分裂产生的若干个子细胞，不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。不能像子代细菌那样各自分散在培养液中。（二）连续培养（continuous culture） 指在培养过程中，指在培养过程中，不断注入新鲜培养基，排不断注入新鲜培养基，排掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养掉用过的培养基，保持培养物的容积恒定，使培养液中的营养物质得到不断补充。液中的营养物质得到不断补充。加入

7、培养基加入培养基排出培养基及其培养物排出培养基及其培养物连续培养图示：连续培养图示：连续培养的类型连续培养的类型封闭型封闭型开放型开放型 排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充，进出数量保持平衡。进出数量保持平衡。封闭型连续培养的特点封闭型连续培养的特点 悬浮在悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来排出液中的细胞经机械方法收集起来之后，又被放回到培养系统中。之后，又被放回到培养系统中。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。 注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液注入的新鲜培养液的体积与流出的原有培养液及其中细胞的

8、容积相等。及其中细胞的容积相等。开放型连续培养的特点开放型连续培养的特点 培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的培养物的生长速度永远保持在一个接近最高值的恒定水平上恒定水平上（通过调节流入和流出的速度）（通过调节流入和流出的速度） 。 开放型培养又可分为两种主要方式：开放型培养又可分为两种主要方式： （控制生长速度的方法）（控制生长速度的方法）一是化学恒定式；一是化学恒定式；二是浊度恒定式。二是浊度恒定式。5.2 细胞悬浮培养的培养基 能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培能用来建立生长快、易散碎的愈伤组织的培养基，一般来说也同样适用于建立该物种的悬浮养基，一般来说也同样适用于建立该物种的

9、悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。培养，只是琼脂当然要从中去掉。条件培养基的使用方法条件培养基的使用方法 简便方法是把在液体培养基中培养了简便方法是把在液体培养基中培养了46周的周的高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层高密度细胞滤掉，而用它的培养基制成悬滴或薄层来培养单细胞或低密度细胞群体。来培养单细胞或低密度细胞群体。 条件培养基条件培养基是在其中曾培养过一段时间植物组是在其中曾培养过一段时间植物组织的培养基。织的培养基。培养基的振荡 首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力使它首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力使它们们破碎成小细胞团和单细胞；破碎成小细胞团和单细胞； 其次，振荡可以使

10、细胞和小细胞团在培养基中保其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持持均匀的分布均匀的分布。此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的间的气体交换气体交换。 在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以在悬浮培养中，为了使培养基能不停地运动，可以使用各种类型的设计。使用各种类型的设计。 (1)旋转培养旋转培养(2)往返震荡培养往返震荡培养(3)旋转震荡培养旋转震荡培养(4)搅动培养搅动培养 液晶屏双层震荡培养器磁力搅拌培养器5.3 5.3 悬浮培养细胞的同步化悬浮培养细胞的同步化 同步培养是指在培养中大多数细胞都能同时通过同步培养是指在培

11、养中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段细胞周期的各个阶段(G1，S，G2和和M)。同步性程度。同步性程度以同步百分数表示。以同步百分数表示。 确定同步性的参数确定同步性的参数在某一时刻处于在某一时刻处于细胞周期某一点细胞周期某一点上的细胞的百上的细胞的百分数；分数；在一个短暂的具体时间内通过在一个短暂的具体时间内通过细胞周期中某一细胞周期中某一点点的细胞的百分数；的细胞的百分数；全部细胞通过全部细胞通过细胞周期中某一点细胞周期中某一点所需的总时间占所需的总时间占细胞周期时间长度的百分数。细胞周期时间长度的百分数。 （一）饥饿法（一）饥饿法 在这种方法中，先对细胞断绝供应一种进行在这种方法

12、中，先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在在G1G1期或期或G2G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进会同步进入入分裂。分裂。入入5.4 5.4 细胞增殖的测定细胞增殖的测定 1. 1. 细胞鲜重细胞鲜重 2.2.细胞干重细胞干重 3.3.细胞密实体积细胞密实体积 为了测定细胞密实体积（为了测定细胞密实体积（packed cell volume, PCV )，将一已知体积的均匀分散的悬浮液，将一已知体积

13、的均匀分散的悬浮液（1020 mL）放入一个刻度离心管（）放入一个刻度离心管（1550 mL）中，在中，在2 0004 000 r/min下离心下离心5 min。细胞密实。细胞密实体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。 注意事项：注意事项： 在测定细胞体积时，有时也用这样的方法：使细胞自在测定细胞体积时，有时也用这样的方法：使细胞自然沉淀，测定其体积，称为然沉淀，测定其体积，称为沉淀体积沉淀体积（settled cell volume)。 4.4.细胞计数细胞计数 用这些物质处理时，有时细胞会被破坏，或者出现变形，用这些物质处理时，有时细胞会被

14、破坏，或者出现变形，所以对每种材料应研究其最适宜的处理方法。所以对每种材料应研究其最适宜的处理方法。 5.5 由悬浮细胞再生植株由悬浮细胞再生植株 在所用培养基适当、继代培养及时的情况下，在所用培养基适当、继代培养及时的情况下，悬浮培养细胞能保持相当长时间悬浮培养细胞能保持相当长时间的植株再生能力。的植株再生能力。 如水稻悬浮细胞每如水稻悬浮细胞每3d继代一次，悬浮培养继代一次，悬浮培养18个月后，其植株再生率仍高达个月后，其植株再生率仍高达90%。由悬浮培养细胞再生植株的途径有两种：由悬浮培养细胞再生植株的途径有两种： 一种是由悬浮细胞直接形成体细胞胚一种是由悬浮细胞直接形成体细胞胚，如在胡

15、，如在胡萝卜的细胞悬浮培养中，在含有萝卜的细胞悬浮培养中，在含有2,4-D的的MS液体培液体培养基中进行悬浮振荡培养，悬浮培养细胞团能够高养基中进行悬浮振荡培养，悬浮培养细胞团能够高频率频率(80%）直接形成体细胞胚。）直接形成体细胞胚。另一种是先将悬浮培养细胞（团）转移到半固体或另一种是先将悬浮培养细胞（团）转移到半固体或固体培养基上，使其增殖形成愈伤组织，然后再由固体培养基上，使其增殖形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。愈伤组织再生植株。 在后一种情况下，如果悬浮培养中的细胞较大，在后一种情况下，如果悬浮培养中的细胞较大，则可将培养瓶短时间静置令细胞团自然沉降后，用则可将培养瓶短时间静

16、置令细胞团自然沉降后，用吸管将细胞团转到半固体培养基上培养。吸管将细胞团转到半固体培养基上培养。 这种培养基的组成基本上与继代培养基一致，这种培养基的组成基本上与继代培养基一致，但也须视情况做些调整，特别是在激素组成方面做但也须视情况做些调整，特别是在激素组成方面做些调整。些调整。 对于单细胞、低密度悬浮细胞、或是过于细小的对于单细胞、低密度悬浮细胞、或是过于细小的细胞团，则不宜直接把它们转到半固体培养基上培细胞团，则不宜直接把它们转到半固体培养基上培养，而是要参照原生质体或单细胞培养方法，先对养，而是要参照原生质体或单细胞培养方法，先对它们进行它们进行液体浅层培养或看护培养液体浅层培养或看护

17、培养，待形成较大的，待形成较大的细胞团后，再转到半固体培养基上诱导愈伤组织。细胞团后，再转到半固体培养基上诱导愈伤组织。5.6 5.6 影响细胞悬浮培养的因素影响细胞悬浮培养的因素 1. 基本培养基的组成基本培养基的组成 (1) 氮源氮源 在具有功能在具有功能NH4+和和NO3- 利用系统的培养利用系统的培养中，中，氮吸收常取决于培养基的氮吸收常取决于培养基的pHpH值和培养物的年龄值和培养物的年龄。例如，矮牵牛悬浮细胞在例如，矮牵牛悬浮细胞在pHpH4.85.6下培养起始吸收下培养起始吸收的的NO3- 比比NH4+ 多，可是在许多情况下，多，可是在许多情况下， NH4+ 只只能在低能在低pH

18、pH值的培养基中被利用。值的培养基中被利用。低浓度的总氮通过低浓度的总氮通过刺激细胞分裂导致大量小细胞的形成，而高浓度的刺激细胞分裂导致大量小细胞的形成，而高浓度的总氮往往利于细胞生长。总氮往往利于细胞生长。 (3)硫硫 硫的缺失使所有蛋白质的合成自动停止。如果硫的缺失使所有蛋白质的合成自动停止。如果含硫氨基酸不能继续产生，它们便不能参加蛋白质含硫氨基酸不能继续产生，它们便不能参加蛋白质的合成。用硫代硫酸盐、的合成。用硫代硫酸盐、L-半胱半胱氨酸、氨酸、L- -甲硫氨酸甲硫氨酸和谷胱甘肽代替无机盐，能使烟草悬浮细胞充分生和谷胱甘肽代替无机盐，能使烟草悬浮细胞充分生长；而长；而D- -半胱氨酸、

19、半胱氨酸、D- -甲硫氨酸和甲硫氨酸和DL- -高半胱氨高半胱氨酸只能使烟草悬浮细胞的生长减少程度保持最低。酸只能使烟草悬浮细胞的生长减少程度保持最低。 (4)镁、钾、钙镁、钾、钙 到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元素是绝对必要的。有关这些元素如素是绝对必要的。有关这些元素如K的最适浓度的最适浓度（胡萝卜为（胡萝卜为l mmol/L,矮牵牛和烟草为矮牵牛和烟草为20 mmol/L)的的研究认为，研究认为，不同培养物在吸收能力方面存在差异。不同培养物在吸收能力方面存在差异。例如，在大豆等植物的培养中，在培养期间几乎所例如，在大豆等植物的培养中，在培养

20、期间几乎所有的有的K都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（20 mmol/L）的一半的）的一半的K留在培养基中未被利用留在培养基中未被利用（Kato等，等，,1977)。(5)氯氯 ClCl一一通常影响光系统通常影响光系统IIII的酶类及液泡形成的酶类及液泡形成体的体的ATPATP酶的活动，干扰细胞的渗透调节酶的活动，干扰细胞的渗透调节（osrnoregulationosrnoregulation) ) 。在许多情况下，在许多情况下，C1C1一一可由可由BrBr一一和和I I一一所

21、代替。所代替。 (6)微量元素微量元素 2.2.有机成分有机成分 (1)氨基酸类氨基酸类 除精氨酸和赖氨酸外，添加作为氮源除精氨酸和赖氨酸外，添加作为氮源NO3- -的替代物的替代物的氨基酸，通常抑制细胞的生长。实际上，在某些情况下，精的氨基酸，通常抑制细胞的生长。实际上，在某些情况下，精氨酸能够补偿其他氨基酸的抑制作用；相反，在颠茄的愈伤组氨酸能够补偿其他氨基酸的抑制作用；相反，在颠茄的愈伤组织培养中，精氨酸又是一种抑制剂；但以织培养中，精氨酸又是一种抑制剂；但以NH4+ +作为氮源时却作为氮源时却没有抑制作用。此外，不同氨基酸之间是相互影响的。在烟草没有抑制作用。此外，不同氨基酸之间是相互

22、影响的。在烟草细胞悬浮培养中，半胱氨酸的吸收受细胞悬浮培养中，半胱氨酸的吸收受L- -亮氨酸、亮氨酸、L- -精氨酸、精氨酸、L- -酪氨酸和酪氨酸和L-脯氨酸的抑制。脯氨酸的抑制。 (2）维生素类）维生素类 对维生素类的需求因植物而异。硫胺素通常对维生素类的需求因植物而异。硫胺素通常是需要的（是需要的（0.1 30 mg/L）。）。在在Convolvulus arvensis悬浮培养中，硫胺素缺乏能够诱导细胞显悬浮培养中，硫胺素缺乏能够诱导细胞显著分裂。在著分裂。在Acer pseudoplatanus悬浮培养中，如果悬浮培养中，如果硫胺素、吡哆酸、半胱氨酸、胆碱、肌醇都缺乏，硫胺素、吡哆酸

23、、半胱氨酸、胆碱、肌醇都缺乏，则悬浮细胞的生长显著下降；但如果仅缺乏其中则悬浮细胞的生长显著下降；但如果仅缺乏其中的一种，则无影响。在少数情况下，发现添加烟的一种，则无影响。在少数情况下，发现添加烟酸和吡哆醇能刺激细胞生长。酸和吡哆醇能刺激细胞生长。3.碳源碳源(1)碳水化合物碳水化合物 培养物对各种碳水化合物的反应取决于所培养的培养物对各种碳水化合物的反应取决于所培养的植物种类和碳水化合物浓度（表植物种类和碳水化合物浓度（表6-3、表、表6-4）。例如，。例如，有些培养物在仅加葡萄糖时便能正常生长，而有些有些培养物在仅加葡萄糖时便能正常生长，而有些培养物需要在培养基中加人果糖或蔗糖（培养物需

24、要在培养基中加人果糖或蔗糖（23%）才能正常生长。肌醇对各种培养物都是必需的。才能正常生长。肌醇对各种培养物都是必需的。(2) CO2 通常，细胞生长随着通常，细胞生长随着CO2 质量分数的增加而质量分数的增加而增加，但也有例外。增加，但也有例外。 为了维持细胞生长以及使光自养培养物完为了维持细胞生长以及使光自养培养物完全绿化，需要连续提供全绿化，需要连续提供2一一5的的CO2。4.4.植物激素植物激素(1)(1)生长素类生长素类 生长素类的影响因所用植物种类及生长素种类生长素类的影响因所用植物种类及生长素种类不同而不同。不同而不同。 2, 4-D特别有利于薄壁细胞的生长，特别有利于薄壁细胞的

25、生长，所以在植物细胞悬浮培养中，常加人适宜浓度的所以在植物细胞悬浮培养中，常加人适宜浓度的2,4-D。(2)细胞分裂素细胞分裂素 细胞分裂素的效果受多种因素的影响，因所选用的植细胞分裂素的效果受多种因素的影响，因所选用的植物种类、激素种类及浓度不同而不同。物种类、激素种类及浓度不同而不同。 植物细胞中的细胞分裂素可被细胞分裂素氧化酶钝化。植物细胞中的细胞分裂素可被细胞分裂素氧化酶钝化。在烟草中，细胞分裂素的降解似乎受到外源细胞分裂素的调在烟草中，细胞分裂素的降解似乎受到外源细胞分裂素的调控，后者导致细胞分裂素氧化酶的迅速增加。控，后者导致细胞分裂素氧化酶的迅速增加。 细胞分裂素诱导细胞分裂细胞分裂素诱导细胞分裂。 有关细胞分裂素的作用位点及作用机理目前所知甚少。有关细胞分裂素的作用位点及作用机理目前所知甚少。 (3)乙烯乙烯 内源乙烯生产是旺盛分裂细胞的特征，因此其生产受内源乙烯生产是旺盛分裂细胞的特征，因此其生产受到生长素到生长素(IAA, NAA, 2 , 4-D）的促进。在非光合培养物中，）的促进。在非光合培养物中，乙烯同其他激素协同作用。乙烯同其他激素协同作用。乙烯诱导细胞