目的基因T载体克隆实验步骤

1、PCR产物的T载体克隆实验原理一. 重组质粒的构建：重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有 Mg 2、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶 切的载体分子与外源 DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌 DNA连接酶。两种 DNA连接酶都有将两 个带有相同粘性末端的 DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌 DNA 连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高 T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加 DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化 DN

2、A 连接反应分为3步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子 ATP形成酶-ATP 复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有 5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后 产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。很多DNA聚合酶在进行 PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3端加上一个突出的碱基A。pUCm-T 载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3端带有一个突岀的 T。这样，pUCm-T 载体的两端就可以和 PCR产物的两端进行正确的 AT配对，在连接酶的催化下， 就可以把PCR产物连接到 pUCm-T 载体中，形成含有目的片断的重组载体。

3、连接反应的温度在 37 C时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。 因此采取折中的温度，即 12-16 C,连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性， 又兼顾到短暂配对结构的稳定。二. 感受态制备原理细菌在0 C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。三. B -半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码3 半乳糖核苷酶。3 半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS 等

4、），常带有3 半乳糖核苷酶的调控序列和 3半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（a肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS ），它并不影响lacZ的表达。另外，常用的大肠杆菌带有3 半乳糖核苷酶 C端部分序列（3肽段），的编码序列。在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的3 半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带a肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成3 半乳糖核苷酶 N端（a肽段），这样就与宿主细胞合成的3 半乳糖核苷酶 C端部分序列（3肽段）互补，形成完整的3 半乳糖核苷酶活性蛋白。而当外源基因插入到此种载体质粒

5、lacZ的多克隆位点后，会造成 lacZ基因不能表达，从而不能合 成3 半乳糖核苷酶；而对于空载体， lacZ基因正常表达，通过 a互补合成3 半乳糖核苷酶，分解培 养基里的色素底物X-gal ，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。X-Gal ,中文名为5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷，分子式为 C14H15BrCINO6，分子量为408.63 ，它是B-半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色。IPTG,中文名，异丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷，分子式：C9H18O5S ，分子量238.30保存温度2-8 C冷藏保存，配制好后保存于-20 C,室温可放置一个月。主要作用：异丙基硫代半乳糖苷（

6、IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒准备100ml超纯水溶液:LB300ml（液体 50ml+50ml，固体 100ml），0.1mol/L CaCI2 10ml， 100mg/mlAmp 1 ml， 20mg/mlX-gal 1 ml ， 200mg/ml IPTG 1 ml。大肠杆菌菌液1ml感受态细胞连接产物4管4 x 5 = 20ul做 4 份目的基因T载体T4连接酶10x冲液4 x 4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL灭菌：5个100ml锥形瓶（外加1个小

7、的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒,10ml超纯水，LB培养基，1.5mlEP管，大小枪头，过滤用具2畐，0.1mol/L CaCI2试剂20mg/ml X-gal x-gai为5-溴-4-氯-3-吲哚-阳 半乳糖苷。用 二基甲酰胺（dmf）溶解X-gal配制成的20mg/ml （取0.02gX-gal,用DMF定容为1ml）的贮存液。保存于一玻璃 管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20 C。X-gal溶液无须过滤除菌。（DMF 二甲基 甲酰胺；Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide; DM

8、F; CAS: 68-12-2理化性质：无色、淡的胺味的液体。分子式 C3-H7-N-O。分子量 73.10。相对密度 0.9445（25 C）。熔点-61C。沸点152.8 C。）200mg/ml IPTG 在0.8ml蒸馏水中溶解0.2g IPTG后，用蒸馏水定容至1ml，用O.22艸滤器过滤除菌，贮存于 -20 C。LB培养基：配制每升培养基，应该在950 ml去离子水中加入：胰化蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质溶解用5mol/LNaOH调pH至7.3.用去离子水定容至1L.在 15psi高压下蒸汽灭菌20min. （ 100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉为固

9、体培 养基）0.1mol/LCaCl2 :取0.11098g氯化钙固体定容至10mlAmp （100mg/ml ）:溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml,用0.22 m滤膜过滤除菌.实验步骤（一）.目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。试剂T载体，T4 DNA连接酶，连接酶缓冲液，无菌dd Water操作步骤PCR产物与T载体直接连接：（1 ） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在1416 C。（2 ） 取4个火菌的200ul微量离心管，加入：（需要调整）4 M目的基因1T载体0

10、.5U T4 DNA 连接酶（TAKARA, 350U/ul）后加1连接酶缓冲液10 x buffer3.5!_ldd Water总量10川体系（3 ） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14 C干式恒温仪（或14 C水中）中保温过夜（12-16h）。（4）连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置4 C冰箱备用。（二）大肠杆菌感受态细胞的制备细菌转化器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml微量离心管，1.5ml微量离心管，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角 烧瓶，接种环，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），酒精灯，玻璃

11、涂棒，恒温培养箱，滤膜和过滤器试剂E. coli菌种，LB培养基，0.1 mol/L CaCl 2溶液，无菌dd Water ，LB培养基（不加抗菌 素），LB培养基（加抗菌素），无菌dd water， IPTG，X-gal。步骤（1） 在超净工作台中，将 1ml大肠杆菌菌液加入 100ml LB液态培养基（不含抗菌素）， 37 C摇床培养过夜。（2）取0.5ml上述菌液转接到含有 50mL LB培养基的三角烧瓶中，37C下250r/min摇床培养 23h,测定 OD590为0.350.4左右（0.4亠0.6，细胞数108/mL，此为关键 参数！）。（注意：此步摇菌的时候，要有一管不加菌的LB

12、培养液同时摇菌）（3）将1ml菌液加入到4支1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min,然后于 4C, 5000rpm 离心 5min。（4）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（5） 4C, 5000rpm离心5min，弃上清液后，用 100卩L冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂 悬，插入冰中放置 2h,可以直接用作转化实验，或立即放入-4摄氏度冰柜中保藏。（6）事先将恒温水浴的温度调到42C。（7）从-70C超低温冰柜中取出一管（100L）感受态菌，立即用手指加温融化后插入 冰上

13、，冰浴510min。（8）加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过 100ng），轻轻震荡后放置冰上 20min。（9）轻轻摇匀后插入 42C水浴中90s进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3min。10）在超净工作台中向上述各管中分别加入300卩L LB培养基（不含抗菌素） 轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37 C震荡1ho（11） 在超净工作台中取上述转化混合液200 L,分别滴到含合适抗菌素 （Amp 100ug/L ）的固体 LB平板培养皿中，再在平板上滴加40L20mg/ml X-gal, 7卩L 200mg/mlIPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：一个不含抗生素作

14、为对照组，玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂，菌液涂皿操作时，应避免 反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞 破裂，影响转化率。）。（12） 在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37C恒温培养箱中 30min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37C恒温培养箱过夜。(13) 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。(14) 观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。(三)转化克隆的筛选和鉴定 器材旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面离心管架，干式恒温气浴(或恒温水浴锅)

15、，制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌 牙签，摇菌管。试剂LB培养基(加抗菌素)，PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内 且酶及其缓冲液， 65%甘油(65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris Cl pH8.0 )。操作步骤方法一：快速 PCR筛选法(1) 在转化的平板培养基上随机选取4个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。(2) 在0.2ml PCR微量离心管中配制 25卩1反应体系。dd water16 110X PCR buffer (不含 MgCl 2)2.5 卩125mM MgCl 21.5

16、口12.5mmol/L dNTP2卩1(每种 dNTP 终浓度 0.2mM )10 mol/L Primer111( 12.5 25pmoles)10 Unol/L primer21 讪(12.5 25pmoles)模板质粒用小tip头轻轻粘一下选中的白色菌落，再伸入 PCR混合液中洗Taq酶总体积(2)根据厂商的操作手册设置0.5 讪(1.5u)25讪PCR仪的循环程序(本实验室已经设置为WZ):94 C5min94 C1min60 C1min72 C1min50s goto 29 times 72C 10min(2) PCR结束后，取10卩产物进行琼脂糖凝胶电泳(与原始插入片断同时比对)。

17、观察胶上是否有预计的主要产物带。(3) 按照编号找到培养皿中的原菌斑。根据需要进行放大培养提取其质粒(4) 提取到的质粒与原先的空载体(或已知分子量的质粒)再对比电泳，以进一步确 认。方法二：提质粒再 PCR或酶切鉴定1)在超净工作台中取 3支无菌摇菌管，各加入 3mL LB (含50g/mL氨苄青霉素)，用 记号笔写好编号。(2) 在超净工作台中将 70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。 用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有 3mL LB (含50g/mL氨苄青霉素)的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入 3个摇菌管中。(3) 37C

18、摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4C冰箱中。(4) 提取到的3管质粒样品可用 PCR法扩增，或用酶切电泳法来鉴定其上是否含有外源 插入片断(方法见有关实验)。(5) 将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500.lL菌液与500.lL 65%甘油混合后-80 C保存。（6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面附：目的基因PCR （选做）在0.2ml PCR微量离心管中配制50卩反应体系。（以下加样量供参考， 括号内是最终需要量， 实验时需参 照Taq酶说明书计算）dd water10 x PCR buffer (不含 MgCI 2) 25mM MgCI 2 2.5mmol/L dNTP10 卩 mol/L Primer110 ；jmol/L primer2模板质粒3U/ pl Taq 酶 总体积根据厂商的操作手册设置PCR仪的;32 pl5 pl3 pl4 p 1(每种dNTP终浓度0.2mM )2 pl( 12.5 25pmoles)2 p