光谱分析 (2)ppt课件

1、1 任务一、了解光学分析法基本知识 任务二、紫外可见分光光度法 实训一、吸收曲线的绘制（721型光光度计手动绘制、UV1240自动绘制） 实训二、吸光系数的测定（721型光光度计手动测定、UV1240自动测定） 实训三、邻菲啰啉显色可见分光光度法测定水中微量Fe含量2 任务一、了解光学分析法基本知识 一、知识点： 1、光学分析法：以电磁辐射为测量信号,从而获得物质组成、结构等定性或定量信息分析的方法。 2、分光光度法：利用待测物质受到光的作用后，根据物质对光的吸收程度不同，而对物质进行定性或定量信息分析的方法。 3、光的性质 （1）电磁辐射（电磁波）：电磁辐射（电磁波）： 不需要任何物质作传播

2、媒介，以接近光速（在真空中为光速）传播的能量。光是一种电磁不需要任何物质作传播媒介，以接近光速（在真空中为光速）传播的能量。光是一种电磁辐射。辐射。 3*电磁辐射的基本性质电磁辐射的基本性质 电磁辐射具有波粒二象性：电磁辐射具有波粒二象性： 波动性：具有一定的频率波动性：具有一定的频率（HZ）、强度、速度，能透过物质）、强度、速度，能透过物质 c = =/ 微粒性：微粒性： “光光” 因而叫光子，具有质量，能产生光电效应。因而叫光子，具有质量，能产生光电效应。 E = h = h c /射线等，因波长小，则能量大，为高辐射，微粒性突出射线等，因波长小，则能量大，为高辐射，微粒性突出 c：光速；

3、光速；：波长；波长；1nm=10-3m=10-6mm=10-9m ：频率；频率； （） ：波数：波数 ； E ：能量：能量(eV)； h：普朗克常数：普朗克常数，4*电磁波谱：按各种电磁辐射的波长、频率大小顺序进行排列电磁波谱：按各种电磁辐射的波长、频率大小顺序进行排列 光学光谱区（中辐射区）波谱区（低辐射区）高辐射区5*4、电磁辐射与物质的相互作用 (1) (1) 吸收吸收 多数物质处于基态，当电磁辐射能恰好等于两能级的能量差时，物质就会选择性数物质处于基态，当电磁辐射能恰好等于两能级的能量差时，物质就会选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；吸收的能量、频率用由普朗克方程求得吸

4、收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；吸收的能量、频率用由普朗克方程求得 (2) (2) 发射发射 受激发的粒子通过弛豫可回到低能态或基态，同时将吸收的能量以光的形式释受激发的粒子通过弛豫可回到低能态或基态，同时将吸收的能量以光的形式释放出，产生发射光谱；放出，产生发射光谱； (3) (3) 散射散射 丁铎尔散射和分子散射；丁铎尔散射和分子散射； (4) (4) 折射折射 折射是光在两种介质中的传播速度不同；折射是光在两种介质中的传播速度不同； (5) (5) 反射反射 (6) (6) 干涉：干涉： 干涉现象；干涉现象； (7) (7) 衍射：衍射： 光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象

5、；光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象； (8) (8) 偏振：偏振： 只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。 6*5、原子光谱与分子光谱、原子光谱与分子光谱 分子光谱复杂，光谱图呈带状，电子跃迁时带有分子振动和分子转分子光谱复杂，光谱图呈带状，电子跃迁时带有分子振动和分子转动能级跃迁；动能级跃迁； 原子光谱简单，为线状光谱，由原子内、外层电子跃迁产生。原子光谱简单，为线状光谱，由原子内、外层电子跃迁产生。 7（）原子发射光谱（）原子发射光谱（AES）；）； 以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子的外层电子受激发射出特征光以火焰、电弧、等离子

6、炬等作为光源，使气态原子的外层电子受激发射出特征光谱进行定量分析的方法。谱进行定量分析的方法。原子光谱原子光谱 （）原子吸收光谱（）原子吸收光谱（AAS）：基于原子外层电）：基于原子外层电子跃迁；子跃迁； 利用特殊光源发射出待测元素的共振线，并利用特殊光源发射出待测元素的共振线，并将溶液中离子转变成气态原子后，测定气态原子将溶液中离子转变成气态原子后，测定气态原子对共振线吸收而进行的定量分析方法。对共振线吸收而进行的定量分析方法。8（）原子荧光分析法（）原子荧光分析法（AFS）：）： 气态原子吸收特征波长的辐射后，外层电子从基态或低能态跃迁到高能态，在气态原子吸收特征波长的辐射后，外层电子从基

7、态或低能态跃迁到高能态，在10-8s后跃回基态或低能态时，发射出与吸收波长相同或不同的荧光辐射，在与后跃回基态或低能态时，发射出与吸收波长相同或不同的荧光辐射，在与光源成光源成90度的方向上，测定荧光强度进行定量分析的方法。度的方向上，测定荧光强度进行定量分析的方法。（）（）X射线荧光分析法（射线荧光分析法（XFS）：）： 基于原子内层电子跃迁的原子受高能辐射，其内层电子发生能级跃迁，发射出特基于原子内层电子跃迁的原子受高能辐射，其内层电子发生能级跃迁，发射出特征征X射线（射线（ X射线荧光），测定其强度可进行定量分析。射线荧光），测定其强度可进行定量分析。9分子光谱（为带状光谱）：分子光谱（

8、为带状光谱）： （）（） 紫外光谱法（紫外光谱法（UV）；）；（）红外光谱法（）红外光谱法（IR）；）；（）分子荧光光谱法（）分子荧光光谱法（MFS）；）； （）分子磷光光谱法（）分子磷光光谱法（MPS）；）；（）核磁共振与顺磁共振波谱（）核磁共振与顺磁共振波谱（N） 分子吸收光谱的产生：分子吸收光谱的产生： 基于分子中电子能级、振动、转能级跃迁产生。基于分子中电子能级、振动、转能级跃迁产生。（1）物质分子内部三种运动形式：）物质分子内部三种运动形式： 电子运动：原子核外电子相对于原子核的运动；电子运动：原子核外电子相对于原子核的运动； 振动：原子核在其平衡位置附近的相对振动；振动：原子核在其

9、平衡位置附近的相对振动； 转动：分子本身绕其重心的转动。转动：分子本身绕其重心的转动。（2）分子具有三种不同能级：）分子具有三种不同能级： 电子能级、振动能级和转动能级。三种能级都具有相应的能量。电子能级、振动能级和转动能级。三种能级都具有相应的能量。 分子的内能电子能量分子的内能电子能量Ee +振动能量振动能量Ev +转动能量转动能量Er。 即即: EEe+Ev+Er，且，且evr1011* 转动能级间的能量差r：0.0050.05eV(电子伏特)，如果用能量很低的远红外光照射分子，分子吸收远红外光跃迁产生远红外吸收光谱或分子转动光谱，波长范围 50m1000m ） 。 振动能级的能量差v约

10、为：0.05eV，跃迁产生近、中红外吸收光谱或分子振动光谱，波长范围 0.8 m 50 m , ） 电子能级的能量差e较大，为120eV。电子跃迁产生紫外可见吸收光谱或分子的电子光谱，吸收光谱在紫外可见光区（200800nm） m 10 3 m m m 10 6 m m 10 9 nmnm = 10 12 pmpm126、吸收光谱具有连续谱的光波通过物质样品时，处于基态的样品原子或分子将吸收特定波长的光而发生能级跃迁，于是在连续谱的背景上出现相应的暗线或暗带，称为吸收光谱。 电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级

11、间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。 13 7 7、单色光和互补光、单色光和互补光 单色光：单波长的光单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成由具有相同能量的光子组成) 互补光：共同组成白光的两种颜色的光。互补光：共同组成白光的两种颜色的光。白光橙光青蓝光青蓝光红光红光青光青光黄光蓝光紫光绿光绿光14白白 光光(太阳光太阳光)红外光（无色）红外光（无色）可见光（有色）可见光（有色）:肉眼能感觉到的光，波长肉眼能感觉到的光，波长400-780 nm。红、橙、黄、。红、橙、黄、绿、青、蓝、紫光绿、青

12、、蓝、紫光紫外光（无色）；近紫外区，波长紫外光（无色）；近紫外区，波长200 - 400 nm的光的光.远紫外区，波长远紫外区，波长10 - 200 nm的光的光8 8、复合光复合光 由各种单色光组成的光。如白光由各种单色光组成的光。如白光15 光的互补：蓝光的互补：蓝 黄黄9 9、物质颜色的产生、物质颜色的产生 （物质分子对光的选择性吸收）（物质分子对光的选择性吸收）例：高锰酸钾可选择性吸收绿光，因而白光中剩下互补光例：高锰酸钾可选择性吸收绿光，因而白光中剩下互补光紫色光，溶液呈紫色。紫色光，溶液呈紫色。16白色光通过无色溶液白色光通过无色溶液溶液呈无色透明溶液呈无色透明白色光通过无色溶液白

13、色光通过无色溶液溶液呈黑色溶液呈黑色不吸收不吸收全吸收全吸收白色光通过无色溶液白色光通过无色溶液溶液呈互补光色溶液呈互补光色部分吸收（有选择性）部分吸收（有选择性）1710、光的吸收定律 朗伯比尔定律 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系 Ab 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A c 二者的结合称为朗伯比耳定律。18 Alg（I0/It)= b c 式中： A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位molL

14、。 ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。 单位 Lmolcm A Alglg（I I0/ /I It)= )= b cb c 式中：与与的关系为：的关系为： = =/M /M （M M为摩尔质量）为摩尔质量） c c：溶液的浓度，单位溶液的浓度，单位g gL L ：质量吸光系数：当于浓度为：质量吸光系数：当于浓度为1 1 g/Lg/L、液层厚度为液层厚度为1 1cmcm时，溶液在某一波长下的吸光度。时，溶液在某一波长下的吸光度。单位单位L Lg gcmcm。 百分吸光系数：百分吸光系数： 浓度为浓度为1g/100ml1g/

15、100ml（1%1%）, ,液层厚度为液层厚度为1 1cmcm时，溶液在某一波长下的吸光度。时，溶液在某一波长下的吸光度。%11cmE19 透光率和吸光度的关系 透光率：描述入射光透过溶液的程度描述入射光透过溶液的程度: 透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance). 用T表示 T = I t / I0 吸光度：透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。 A lg T A愈大，溶液对光的吸收愈多。t0lglgII=T-=A20 物质对光的吸收偏离朗伯物质对光的吸收偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当

16、溶液浓度较高时），标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 引起偏离的因素（两大类）：引起偏离的因素（两大类）： 1 1、 物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的； 2 2、化学性因素。、化学性因素。21 物理性因素物理性因素 分光光度计只能获取近乎单色的狭窄光带。分光光度计只能获取近乎单色的狭窄光带。 因而，复合光可导致对朗伯因而，复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会比耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光

17、都会引起对朗伯引起对朗伯比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。应选择比较好的单比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。应选择比较好的单色器。色器。 化学性因素化学性因素 朗伯朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液( (c10-c10 c 10 2 2 mol/L mol/L 时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯收。故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液 。2211

18、11、吸收光谱曲线、最大吸收波长、吸收光谱曲线、最大吸收波长 吸收曲线：将不同波长的单色光依次通过溶液，测量溶液的吸光度A，以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸收曲线。最大吸收波长 吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示。 定性鉴别物质的依据max 定量分析的依据不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。右图：四种浓度的KMnO4的吸收曲线。.23讨论：讨论： （1）同一种物质，对不同波长光的吸光度不同。不同物质的）同一种物质，对不同波长光的吸光度不同。不同物质的max有有时可能相同，但时可能相同，但max不一定相同。不一定相同。 （2）同

19、一种物质，浓度不同，其吸收曲线形状相似）同一种物质，浓度不同，其吸收曲线形状相似max不变。不变。 （）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和（）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和max则不同。则不同。24任务二、紫外可见分光光度法 一、知识点： 分光光度计的结构构成 分光光度计的光路原理 分光光度计的类型及特点 250.5750.575光源单色器样品池检测器显示显示光源单色器样品室（吸收池）检测器信号显示器26氘灯氘灯钨灯钨灯样样品品池池检测器检测器入射狭缝入射狭缝出射狭缝出射狭缝聚焦装置聚焦装置透镜透镜透镜透镜271. 1. 光源光源 是仪器中提供入射光的装置。可以提供紫外或可见光。是仪器中提

20、供入射光的装置。可以提供紫外或可见光。 具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 常用光源有两种：常用光源有两种： （）可见光源（）可见光源400400800 nm800 nm（如（如叫碘钨灯）：叫碘钨灯）：28（）紫外光源工作气体（氢气、氘气）在阴阳两极间放电，发射出1 16060375 nm375 nm波长范围的紫外连续光谱。 A A、氢灯：、氢灯：根据阴阳极电压高低不同，又分为低压氢灯和高压氢灯。 B B、氘灯：、氘灯：现在多用氘灯，氘灯的辐射强度大于氢灯。氘灯的辐射强度大于氢灯。 岛津岛津UV2450型、型、 UV mini-

21、1240型紫外可见分光光度计均具有碘钨灯和氘灯两种型紫外可见分光光度计均具有碘钨灯和氘灯两种光源。可发射光的波长范围为：光源。可发射光的波长范围为： nm。29 2.2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出任意波长的单色光，这样一个光学系统。将光源发射的复合光分解成单色光，并可从中选出任意波长的单色光，这样一个光学系统。入射狭缝：光源的光由此进入单色器，调节狭缝宽度可以调节入射光的强度。入射狭缝：光源的光由此进入单色器，调节狭缝宽度可以调节入射光的强度。 准光装置：使入射光成为平行光束（含透镜、反射镜）准光装置：使入射光成为平行光束（含透镜、反射镜） 聚焦装置：透镜或凹面

22、反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝。聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝。 30出射狭缝：只让所需单色光通过，进入样品池。出射狭缝：只让所需单色光通过，进入样品池。色散元件（棱镜色散元件（棱镜/光栅）：将复合光分解成单色光，光栅）：将复合光分解成单色光， 单色器部件最关键的部件。单色器部件最关键的部件。 利用不同波长的光有不同利用不同波长的光有不同 的折射率而使复合光分开的光学元件。的折射率而使复合光分开的光学元件。 有石英棱镜、玻璃棱镜两种：有石英棱镜、玻璃棱镜两种：石英棱镜可用于紫外光区光谱的分光石英棱镜可用于紫外光区光谱的分光玻璃棱镜只用于可见光区光谱的分光

23、玻璃棱镜只用于可见光区光谱的分光31棱镜光路图棱镜光路图32光栅光路图光栅光路图 利用光的衍射和干涉原理使复合光色散。利用光的衍射和干涉原理使复合光色散。33 3. 3. 样品室（吸收池）样品室（吸收池） 分光光度计中用来盛放溶液的容器分光光度计中用来盛放溶液的容器 样品室放置吸收池（样品池、比色皿）和相应的池架附件。样品室放置吸收池（样品池、比色皿）和相应的池架附件。 吸收池主要有石英池和玻璃池两种：吸收池主要有石英池和玻璃池两种： 石英池：用于紫外区石英池：用于紫外区 玻璃池：用于可见区。玻璃池：用于可见区。比色皿的规格：用厚度（光束通过溶液的路径长度）表示：比色皿的规格：用厚度（光束通过

24、溶液的路径长度）表示： 1mm 1mm、2mm2mm、5mm5mm、1cm1cm、2cm2cm、4cm4cm。定量测定时，所使用的一组样品池的规格要完全一致。定量测定时，所使用的一组样品池的规格要完全一致。 344. 4. 检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。检测器：通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。（1 1）光电转换器：）光电转换器： 利用光电效应将透过吸收池的光信号转化为可以测量的电信号的器件。利用光电效应将透过吸收池的光信号转化为可以测量的电信号的器件。应用波段应用波段1901901100nm1100nm有：有：光电管（光电管（640

25、06400型火焰光度计的检测器上使用）型火焰光度计的检测器上使用） 光电倍增管（光电倍增管（ UV24 UV240 0型紫外可见分光光度计上用）型紫外可见分光光度计上用） 二极管阵列检测器二极管阵列检测器 光电晶体管（光电晶体管（ UVmini1240UVmini1240型紫外可见分光光度计上用型紫外可见分光光度计上用）在分光光度计中常用检测器：光电管、光电倍增管。35光电管 光电管内装有一个阴极和丝状阳极，两极间加有高压。 阴极的凹面涂一层对光敏感的碱金属或碱金属氧化物，当光线照射时，阴极金属物质由于光电效应而发射出自由电子，在阴阳两极间高压电场作用下加速射向阳极而形成电流。光越强，放出的电

26、子越多，电流就越强。电流通过光电管负载电阻，即可变成电压信号，经放大后将信号输给信号显示装置。36光电倍增管光电倍增管 与光电管结构上的差别： 在涂有光敏金属的阴极和阳极之间还有9-169-16个个倍增光敏阴极。 当单色器分出的光照射到外加有负压的光敏阴极K上，轰击光敏材料，发射出一次光电子，一次光电子又射向第一倍增极（打拿极），轰击出二次光电子，二次光电子又射向第二倍增极（打拿极），轰击出更多的光电子，依次倍增，在最后放出的光电子，比最初增加106倍以上，这此电子最后射向阳极，形成电流。 最大电流可达 10A，电流经负载电阻转变为电压信号送入放大器，经放大后将信号输入显示装置。 37二极管阵

27、列检测器 微型紫外分光光度计常用二极管阵列检测器，体积小。二极管阵列检测器由集成在硅片上的几百个至上千个光敏二极管、场效应管及移位寄存器所组成。385. 5. 结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理。39 721型可见分光光度计40721型可见分光光度计（模型）4142722型可见分光光度计4344日本岛津Uvmini-1240型紫外-可见分光光度计45日本岛津UV2450型紫外可见分光光度计波长范围：190-900nm，双光束方式 光电倍增管检测器4647分光光度计的类型及特点分光光度计的类型及特点

28、根据仪器光学系统的不同，紫外分光光度计分为有两类：单波长分光光度计双波长分光光度计单光束分光光度计双光束分光光度计481. 1. 单光束单光束分光光度计由一束经过单色器的光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光强度测量。由一束经过单色器的光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光强度测量。 特点是：结构简单特点是：结构简单 、价格便宜、价格便宜 ，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，主要适，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，主要适于做定量分析。于做定量分析。缺点是：测量结果受电源的波动影响较大，容易给定量结果带来较大误差，对光源缺点是：测量结果受电源的波动影响较大，容易给定量结果带来较大误

29、差，对光源和检测器等电学组件的质量要求很高具有的稳定性。和检测器等电学组件的质量要求很高具有的稳定性。 主要有国产的主要有国产的721721型、型、 751751型型 、岛津岛津UVmini-1240UVmini-1240型型49单波长单光束分光光度计结构及原理示意图0.575光源单色器样品池检测器显示参比池50 2 2、双光束紫外分光光度计、双光束紫外分光光度计 光源发出的复合光，经单色器色散为单色光，此单色光经过切光器，将其分成光源发出的复合光，经单色器色散为单色光，此单色光经过切光器，将其分成S S、R R两束光线，并分别通过样品池和参比池，各自到达检测器（光电倍增管），并把来自两两束光

30、线，并分别通过样品池和参比池，各自到达检测器（光电倍增管），并把来自两光束的电信号加以比较，获得吸光度的差值光束的电信号加以比较，获得吸光度的差值AA，进行定量分析。，进行定量分析。双光束分光光度计的特点：双光束分光光度计的特点：因样品溶液、空白溶液的对比测定几乎同时进行，不会受到光源与检测系统漂移产生的因样品溶液、空白溶液的对比测定几乎同时进行，不会受到光源与检测系统漂移产生的影响，可消除背景干扰。但光路复杂、价格高。如日本岛津影响，可消除背景干扰。但光路复杂、价格高。如日本岛津UV2450UV2450型紫外可见分光光型紫外可见分光光度计度计51差值A光源单色器吸收池检测器显示切光器单波长双

31、光束分光光度计结构及原理图参比池双道双道523 3、双波长、双波长分光光度计 光源辐射通过两个单色器，分出两束不同波长的光光源辐射通过两个单色器，分出两束不同波长的光( (1 1、2 2) ) ，经切光器并束后于不，经切光器并束后于不同时间、交替通过盛有同时间、交替通过盛有“空白空白+ +试样试样”溶液的吸收池（无需参比池），而后到达检测器，溶液的吸收池（无需参比池），而后到达检测器，经仪器的电子学装置直接获得两光束的吸光度之差经仪器的电子学装置直接获得两光束的吸光度之差AA进行定量分析。进行定量分析。53单色器.吸收池检测器1122双波长分光光度计结构及原理图双波长分光光度计结构及原理图单色

32、器1切光器切光器54任务二、紫外可见分光光度法知识点：分析条件的选择技能点：实训一、吸收曲线的绘制（721型光光度计手动绘制、UV1240自动绘制）实训二、吸光系数的测定（721型光光度计手动测定、UV1240自动测定）实训三、物质含量测定 邻菲啰啉显色可见分光光度法测定水中微量Fe含量 55知识点：分析条件的选择一、显色反应条件的选择一、显色反应条件的选择二、仪器测定条件的选择二、仪器测定条件的选择三、参比溶液的选择三、参比溶液的选择一、显色反应条件的选择一、显色反应条件的选择1.显色反应要求显色反应要求 显色剂选择性好，显色反应灵敏度高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显显色剂选择性好，

33、显色反应灵敏度高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显吸收，显色剂与产物的颜色差异明显，要求两种有色物之间最大吸收波长之差吸收，显色剂与产物的颜色差异明显，要求两种有色物之间最大吸收波长之差“对对比度比度”： 60nm。56显色剂显色剂 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多有机显色剂：种类繁多（）（）三苯甲烷类三苯甲烷类：铬天青铬天青S S( (AlAl3 3+)+)、二甲酚橙、二甲酚橙( (FeFe3 3+ +、CuCu2 2+ +、BiBi3 3+ +、PbPb2 2+)+)等等（）偶氮类显色剂（）偶氮类显色剂：

34、本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。如偶氮胂如偶氮胂( (测测CaCa2 2+ +、PbPb2 2+)+)、邻菲罗啉（、邻菲罗啉（FeFe2 2+ +、CuCu2 2+ +）等等。 572.2.显色剂浓度、用量显色剂浓度、用量 吸光度吸光度A A与显色剂用量与显色剂用量CRCR的关系会出现的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。3.3.溶液的酸度

35、溶液的酸度 在相同实验条件下，分别测定不同在相同实验条件下，分别测定不同pHpH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pHpH范围。有色物本身是一种配合物。范围。有色物本身是一种配合物。4.4.显色时间与温度显色时间与温度 实验确定，一般实验确定，一般min.min.有的在常温有的要加热，应保持标准系列有的在常温有的要加热，应保持标准系列与样品测定一致与样品测定一致5.5.溶剂：溶剂： 一般尽量采用有机溶剂测定一般尽量采用有机溶剂测定. .提高有色物质的稳定性提高有色物质的稳定性586 6、显色反

36、应中的共存离子的干扰及消除、显色反应中的共存离子的干扰及消除干扰：干扰： 生成有色物质使结果偏高生成有色物质使结果偏高 共存离子本身有色共存离子本身有色 消耗显色剂，妨碍正常显色消耗显色剂，妨碍正常显色消除方法：消除方法： （1 1）加入掩蔽剂）加入掩蔽剂 选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。产物不干扰待测组分的测定。 例如：用铬天菁例如：用铬天菁S S光度法测定光度法测定AlAl3+3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将FeFe3

37、+3+还原为还原为FeFe2+2+，消除消除FeFe3+3+的干扰。的干扰。 （2 2）分离干扰离子（如萃取分离法）分离干扰离子（如萃取分离法） （3 3）选择适当的显色反应条件（如酸度）和测定条件（如入射波长参比溶液）。）选择适当的显色反应条件（如酸度）和测定条件（如入射波长参比溶液）。 59二、仪器测定条件的选择二、仪器测定条件的选择1.1.选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般应该选择一般应该选择maxmax为入射光波长。为入射光波长。 如果如果maxmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波

38、长。长。60三、参比溶液选择三、参比溶液选择 通过适当组分的溶液作为调节仪器通过适当组分的溶液作为调节仪器 A A值（值（A=0A=0）或）或T(T(透光率透光率T=100%)T=100%)，以消除吸收池试剂等，以消除吸收池试剂等对入射光的吸收，使测得的吸光度真正反映待测溶液的吸光强度。对入射光的吸收，使测得的吸光度真正反映待测溶液的吸光强度。参比溶液类型及选择原则：参比溶液类型及选择原则： 溶剂参比：如只有待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，可用溶剂作参比溶溶剂参比：如只有待测组分与显色剂的反应产物在测定波长处有吸收，可用溶剂作参比溶液，以消除吸收池、试剂等因素的影响；液，以消除吸

39、收池、试剂等因素的影响； 试剂参比：若显色剂或其它所加试剂在测定波长处也略有吸收，则按显色反应相同条件加试剂参比：若显色剂或其它所加试剂在测定波长处也略有吸收，则按显色反应相同条件加试剂、显色剂和溶剂，只是不加试样，是又叫试剂、显色剂和溶剂，只是不加试样，是又叫“试剂空白试剂空白”( (不加试样溶液不加试样溶液) )参比溶液。参比溶液。61 试液（样品）参比：若待测试液中干扰组分在测定波长处有吸收，但不与显色剂起显色试液（样品）参比：若待测试液中干扰组分在测定波长处有吸收，但不与显色剂起显色反应，则可用反应，则可用“试样空白试样空白”( (不加显色剂的样品溶液不加显色剂的样品溶液) )作参比溶

40、液；其它应加的试剂应与加显作参比溶液；其它应加的试剂应与加显色剂的待测样品溶液同样进行。色剂的待测样品溶液同样进行。 褪色参比（平行操作参比）：若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可褪色参比（平行操作参比）：若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可让显色的试液加入适当褪色剂，将显色的待测液褪色作为参比溶液。让显色的试液加入适当褪色剂，将显色的待测液褪色作为参比溶液。62四四. .选择适当的待测溶液浓度，以控制适宜的吸光度读数范围选择适当的待测溶液浓度，以控制适宜的吸光度读数范围 不同的透光度读数，产生的误差大小不同，浓度测量值的相对误差（不同的透光度读数，产生的误差大小不同，

41、浓度测量值的相对误差（c c/ /c c）不仅与仪不仅与仪器的透光度误差器的透光度误差T T 有关，而且与其透光度读数有关，而且与其透光度读数T T 的值也有关。的值也有关。 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在：用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在： T T %=20%=2065% 65% 吸光度吸光度 A A =0.70=0.700.200.20。 63实训一、吸收曲线的绘制（721型光光度计手动绘制、UV1240自动绘制） 一、721型分光光度计操作（1）在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于“0”刻线上，若不在零点，则调节电表上零点校正螺丝，使指针至“0”。 （2）打开比色皿暗盒盖已关闭

42、光门，打开电源开关，预热仪器20min。（3）将波长调节旋钮调至所需波长，将灵敏选择预置于“1”档。（4）用“0”透光率调节旋钮将仪器调节在透光率“0”处，常称此操作为调节机械零点。64（5）将装有溶液的比色皿放入比色皿架中。盖上比色皿暗盒盖，此时光路开启。让参比溶液置于光路上，用“100%”透光率调节旋钮使电表指针指在透光率100%位置（即A=0.00）（6）重复几次打开、关上比色皿暗盒盖，反复调整透光率“0”和“100%”,待指示稳定后，方可开始测量。（7）将待测溶液推入光路，读取吸光度。读数后将比色皿暗盒盖打开。（8）每当改变波长测量时，必须重新校正透光率“0”和“100%”。（9）仪器

43、使用完毕，取出比色皿，洗净、晾干。关闭电源开关，拔下电源插头，复原仪器。 65（二） 自动绘制吸收曲线 仪器：岛津UV1240型紫外可见分光光度计 天津UV5501型紫外可见分光光度计 662、仪器：岛津UV1240型紫外可见分光光度计 单元-显示操作菜单和测量结果键盘：-输入操作指令和数值67岛津岛津UVmini-1240型紫外型紫外可见分光光度计可见分光光度计仪器面板仪器面板68岛津岛津UVmini-1240UVmini-1240型型紫外可见分光光度计仪器键盘键盘：START/SFOP:参数设置好后,按下该健开始测定,或停止测定.AUTO ZERO:将波长下的读数自动归零GOTO WL:改

44、变当前波长设置ENTER:当输入数值(如波长),或显示模式,必须按下该健确认.光标():可选一个项目,左右移动液晶屏上的光标,左光标还用于输入负数.功能键:与液晶屏显示的功能相对应RETURN:可以从当前屏幕反回前一屏幕LCD CONT:按该健同时按住光标健,可改变液晶屏幕显示的对比度.PRINT:输出到打印机数字键:输入数值CE键:用该健清除数值输入的错误,重新输入数值69一、预备操作1、开机前确认样品室里没有样品或其他东西档住光路。2、关好样品室，打开电源开关，仪器开始初始化，直至初始化画面上每一项都显示“OK”。3、仪器初始化完成并预热10分钟后，根据自己的检测需要按数字键选择相对应的测

45、量模式。 光度模式：单点法测含量时选用 光谱模式：测吸收曲线（最大吸收波长）时选用 定量模式：多点法测含量时选用70二、系统设置操作 按数字键“5”进入系统设置模式，在“系统设置”模式下： 按数字键“1”进入启动程序设置 按数字键“2” 进入显示数据设置 按“3”进入光源设置，波长200400nm设氘灯，波长400800nm设钨灯，按“ENTER”键确认。， 按“5”进入时钟设置 按“6”进入蜂鸣设置71三、测定操作（一）绘吸收曲线、测最大吸收波长 -光谱测定模式 按“返回键”，在初始化画面上按按数字键“2”进入光谱测定模式。 在光谱测定模式下，按“1”，设定测定方式：有吸光度ABS/透光率T

46、/energy三种，选吸光度ABS，按 “ENTER”键确认。 在光谱测定模式下，按“2”设定波长范围。200-400 将空白样品置于样品室并关紧样品室，按“F1”仪器进行自动基线校正。72 听到蜂鸣声表示已经校正基线，将空白溶液换成样品，关紧样品室，按“START/STOP”键，仪器开始自动扫描，测量样品在不同波长下的吸光度，屏幕上显示以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标的吸收光谱曲线。 听到蜂鸣声表示扫描完毕，按“F2”即得到峰表，显示峰检测，横坐标下即为最大吸收波长。（ Vc的最大吸收波长245nm）73 （二）单点法测物质含量 吸光度模式、对照品比较法测定物质含量 按“返回键”，在初始化画

47、面上按数字键“1”进入光度测定模式 按“GOTO WL”设定波长（被测物质的最大吸收波长）并按“ENTER”键确认。 按相应的功能键“F1F4”输入需要测定的参数。 将装有空白样品的比色皿放入样品室，并关好样品室。 按“AUTO ZERO”键进行自动调零。 将空白样品拿出倒掉，分别装入标样/样品，并关紧样品室（仍是同一比色皿）。 按功能键F1切换测定物质的吸光度ABS，按“START/STOP”键，分别进行标样/样品测试，或按功能键F3后再按“START/STOP”键进入测试，得出待测吸光度A。 样品浓度的计算：CX=（AX/AS）CS （ %或g/ml）74对照品比较法特点： 能消除仪器误差

48、，但需要对照品，美国药典多用此法，中国药典应用不多，主要有：水杨酸镁、阿莫西林、氨苄西林钠、贝诺酯。对照品比较法实例： 精密称取贝诺酯药品0.0750g，用无水乙醇定容到50ml，再定量稀释200倍后，在240nm波长处测定其吸光度（设为0.5585）。另取105干燥2hr的贝诺酯对照品0.0400g用无水乙醇定容到50ml，配成8.0g/ml的对照品溶液(100倍)，同样测定其吸光度（设为0.5960），计算贝诺酯药品中贝诺酯的百分含量。结果计算式：）（C）（AACRRXX对照品溶液浓度对照品吸光度供试溶液吸光度供试品溶液浓度)(%100(100750.05020085960.0)(5585

49、.0)(%6）gmlArAX样品重量倍对照品溶液吸光度供试溶液吸光度贝诺酯75（二）单点法测物质含量 吸光度模式、吸收系数法测定物质含量 按“返回键”，在初始化画面上按数字键“1”进入 光度测定模式 按“GOTO WL”设定波长（被测物质的最大吸收波长） 并按“ENTER”键确认。 按相应的功能键“F1F4”输入需要测定的参数。 将装有空白样品的比色皿放入样品室，并关好样品室。 按“AUTO ZERO”键进行自动调零。 将空白样品拿出倒掉，装入样品，并关紧样品室 （仍是同一比色皿）。 按功能键F1切换测定物质的吸光度ABS，按“START/STOP”键进行待测溶液测试，或按功能键F3后再按“S

50、TART/STOP”键进入待测溶液测试，得出待测溶液的吸光度A。76吸收系数法原理A=ECL C=A/EL%1100/(%11cmEAml）gC测试液浓度%100%1%11）W（EAcm样品重量供试液总体积稀释倍数供试品含量可从中国药典查到%11cmE值厚时的液层溶液浓度为Ecm、mlg（Ecm1)100/1%1,%11,:100/1:%11CAmlgEcm77吸收系数法特点： 不需要对照品 ，英国药典多用此法，但仪器误差大（如波长、吸收池误差），中国药典多用此法实例： 精密称取VB12药片0.0075g，用水溶解，定容到50ml，再定量稀释5倍后，在361nm波长处测定其吸光度（设为 0.5

51、80）。查中国药典知本品的吸光度为 计算其百分含量。结果计算式：207%11为cmE%100%1%11）W（EAcm样品重量供试液总体积稀释倍数供试品含量%100%)51(0075.0505%1207580.012含量维生素B78%1100/(%11cmEAml）gC测试液浓度可从中国药典查到%11cmE%100%1%11）W（EAcm样品重量供试液总体积稀释倍数供试品含量值厚时的液层溶液浓度为Ecm、mlg（Ecm1)100/1%1,%11,:100/1:%11CAmlgEcm待测溶液浓度的计算：吸收系数法A=ECL C=A/EL20712%11为的如cmEVB79（三）多点法测物质含量（标

52、准曲线法） 先配制一系列浓度少不同的标准溶液（成梯度），在同一条件下分别测定其A值，然后绘制其AC图（工作曲线）。再在同样条件下测定样品的A值，从AC工作曲线上查出样品的C值，最后计算出样品的含量。 特点： 不需知道 ， 对仪器要求不高 ，但操作麻烦，需要标准品。%11cmE801、定量设定 按“返回键”，在初始化画面上-模式选择屏幕中选择， 显示仪器处于定量模式。 在定量模式下按1进入，再选“1”单波长，再输入最大吸收波长, 按“ENTER”键确认。 在定量模式下按“2”进入定量方法设定，再按“3”设定多点校准， 再设定多点校准下的标准个数为“4”（一个空白样品，三个标样）， 按“ENTER

53、”键确认。 在定量模式下按3进入设定，输入1测定一次。按“ENTER”键 确认，过原点：“是”，按“ENTER”键确认。 在定量模式下按4进入设定，要与样品实际单位一致。 在定量模式，屏幕下方出现“取得ABS值的方法？”这时按数字键2，选2812、测定 定量方法设定后，按“START/STOP”键，屏幕上面出现出现标样表。 进入标样的浓度的输入，要求输入标样浓度值，依次输入一个空白溶液浓度（0.00）和三个标样的浓度值（ 8.0g/ml 、16 g/ml、24 g/ml ），都按“ENTER”键确认 依次放入四个样品（一个空白和三个标样），每次按“START/STOP”键，依次测量出四个样品（

54、1空白、3标样）的吸光度。 换成待测样品放入比色池，再按“START/STOP”键，显示待测样品的吸光度和浓度。或者按“F3”样品测定，再按“START/STOP”键同样进入待测样品的测定。82天津天津UV5501型紫外可见分光光度计型紫外可见分光光度计SETstartESC/STOPENTERF1F2F3F40Abs/100%TSave83天津UV5501型紫外可见分光光度计操作方法 打开电源，仪器进行自检，等15分钟后进入主菜单一、吸收曲线（波长扫描） 1、在主菜单下选择1 进入光度计模式，将空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T进行本底测量，显示校准（Blanking） 2、按SE

55、T设置波长，从键盘输入波长，按回车盘（ENTER）确认设置，自动进行本底测量，显示：0.000 Abs 3、在主菜单下按3选择“光谱扫描”。 4、按F1（扫描设置）设定起始波长、终止波长，扫描间隔设为0.5nm，抛描速度设“高速”。84 5、按F2（模式）选择测量模式，选“吸光度”模式 6、将空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T扫描基线。按ESC/STOP停止扫描。 7、将装有样品的比色皿推入光路中，按START开始扫描样品，得到吸收曲线，按ESC/STOP停止扫描 8、按F3（检索），配合、，逐点查吸收曲线上各点上的Abs值与波长值，配合、逐峰查吸收曲线上各峰上的Abs值与波长值。结

56、果将显示在屏幕右上角。85二、样品测定（一）样品吸光度测定：1、将空白比色皿推入光路中，在主菜单下选择1 进入“光度计模式” ，自动进行本底测量，显示：0.000 Abs，等待操作下一步2、按F2（模式）选择测量模式，选“吸光度”模式，按0Abs/100%T 进行校准（Blanking）3、将样品比色皿推入光路中，读取数据Abs值。86（二）对照品比较法测定物质含量1、按F1（设置单位）mg/l（用方向键选择单位或自定义单位如g/l）。2、将空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T 进行本底测量3、将装有标样的比色皿推入光路中，按F4（标样测定），输入标样己知浓度值C，将装有样品的比色皿推

57、入光路中，读取样品浓度值。87（三）标准曲线法测定样品 1、在主菜单下按F2，选择“定量测试”，按F1（单位），选择浓度单位 2、按SET设置波长、校正方法为标准曲线（单点/标准曲线/3点），按两次ESC/STOP，选F2（拟合曲线），按F1选拟合方法为“线性拟合/线性过0点”，按F3（标样设定），通过测定一组标准样品的测定建立工作曲线（即输入样品的标准浓度，每次输入后按ENTER），按ESC/STOP退出。 3、将空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T ，进行校准（Blanking）884、将一组将有标准样品的比色皿逐个推入光路，每次按START，按F4画出曲线，按SAVE保存曲线，按

58、ESC/STOP退出。5、将空白比色皿推入光路中，按0Abs/100%T进行本底测量，将样品比色皿推入光路中，每次按START，结果将显示在屏幕上。6、按SAVE保存结果和拟合参数。 ID Abs Conc.(mg/l)或g/l 1 0.062 0.076 2 0.065 0.07889 实训三 邻菲啰啉分光光度法测定水中微量Fe的含量 1、试剂：标准硫酸亚铁、铁铵矾（硫酸亚铁铵）、邻二氮菲（1.5g/L）、盐酸羟胺（100g/L ）、HAC-NaAC缓冲溶液 2、原理 邻二氮菲是铁的显色剂，在PH为29时与亚铁离子生成橙红色配合物，但与Fe3+生成 的配合物为蓝色，所以，事先要加盐酸羟胺还原

59、剂将Fe3+还原成亚铁离子。由于亚铁离子易水解，所在要加HAC-NaAC缓冲溶液，稳定PH在56，防止亚铁离子水解，使显色完全。 取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。 在相同条件下，测量被测溶液的吸光度。 在标准曲线上查得溶液浓度。90 3、工作曲线的绘制 （1）配铁标准溶液： 称取0.4317g硫酸亚铁标样加6ml/L HCl 20ml，用蒸馏水定容到500ml(浓度100ug/ml) （2）配Fe 标准系列： 取铁标准溶液25ml稀到500ml，浓度5 ug/ml(标样2) 分别取标样2 0.00ml 5.00ml 10.00ml 20.00ml到50ml容量瓶中， 分别加邻二氮菲5ml、盐酸羟胺1ml、HAC-NaAC缓冲溶液5ml，定容到50ml。 标准系列： 0.00ug/ml、 0.50、 1.00、 2.00ug/ml91标准曲线 C92 4、最大吸收波长测定（440580nm每隔10nm测一次A值，作吸收曲线，确定最大吸收波长max 5、样品测定操作 （1） 取自来水30.00ml,分别加邻二氮菲5ml、盐酸羟胺1ml、HAC-NaAC缓冲溶液5ml，定容到50ml。 （2）在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于