【家蚕幼虫黄白血液蛋白差异的双向电泳分析】石蚕幼虫

1、【家蚕幼虫黄白血液蛋白差异的双向电泳分析】石蚕幼虫摘要：试验利用黄白茧色限性品种Y92为材料，在4、5龄幼虫期，测定了黄血蚕（雌）、白血蚕（雄）的血液蛋白质含量的消长变化，幼虫血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多，至5龄期第八天到达最高值，黄血蚕94.36白血蚕54.82g/wL。利用双向电泳技术，比较5龄期第六天幼虫黄、白血液的蛋白质差异，在蛋白质电泳图谱中，黄、白血蚕总共检测到507个蛋白点，其中黄血蚕有287个蛋白点，白血蚕有220个蛋白点，两者能匹配的蛋白点有205对，匹配率达到80.9%;特异性蛋白点，黄血蚕有82个，白血蚕有15个。关键词：家蚕幼虫；黄白血液；蛋白质；电泳分析:S881

2、.2+4:A:04398114（2011）102128-03ComparisonbetweenYellowB1oodProteinsandWhiteBloodProteinsofBombyxmoriLarvaebyTwoDimentionalElectrophoresisKONGQing-mningl,ZHONGYangshgl,LINJianrongl,LINBi-rniin1,GUODingguo2,LIN(1.CollegeofAniWANGmalScience,Sosiu1houthChiculturalUniver510642,onCeu510640,China)Abstract:I

3、nthisa1Seriethelimitedbreedyelcocoonsilkworminowanthe4thad5thinstarwereusedtoanalisthemetabolicruleofbloodproteins.TheresultsshowedthattheproteincontentinthebloodofBombyxmorilarvaeincreasedwithgrowingandreachedpeakinthe8thdayofthe5thinstar.Foryellowbloodsilkworm(female)itwas94.36andforwhitebloodsilk

4、worm(male)itwas54.82Usingtwodimensionalelectrophoresis(2DE)andgelimageanalysissystem,theproteinsinmaleandfemalebloodofsilkwormatthe6thdayinthe5thinstarwerecompared.Atotalof507proteinspotsweredetectedinthe2DEpatternofmaleandfemaleblood,ofwhich287belongedtofemaleand220belongedtomale.Comparisonshowedth

5、at205pairswerematchedinthe2DEpatternsofbothmaleandfemale,withthematchpercentageashighas80.9%.Thereare85proteinspotsspecifictofemaleand15specifictomale.Keywords:Bombyxmorilarvae;yellowandwhiteblood;protein;electrophoresisanalysis家蚕是一种绢丝昆虫，一直是生物学研究的模式昆虫，由于蚕能够泌丝结茧，因而具有很高的经济利用价值。近年，蚕业科技工作者进一步对天然彩色茧丝资源进行

6、了拓展利用，并就彩色茧形成的机理作深入地研究。J。un1等1通过硫酸镂沉淀、浓缩和阴离子交换层析等技术，在结黄茧的5龄幼虫中肠中发现了一种叶黄素结合蛋白(luteinbindingprotein,LBP),该蛋白的等电点为5.4,相对分子量35kDoTabunok1等2在家蚕黄茧品种的丝腺组织中分离纯化出一种类胡萝卜素结合蛋白(carotenoidbindingprotein,CBP),并对其进行了cDNA的序列分析，CBP的表达由显性的黄血Y基因调控，含297个氨基酸残基，大小为33kD,以1:1的摩尔比结合叶黄素，该蛋白在中肠上皮细胞和中部丝腺内膜中发挥着辅助吸收和再分配类胡萝卜素的功能。

7、Tsuchida等3以4种家蚕突变体为材料，通过对脂肪酸转运与代谢的研究，认为家蚕Y基因隐性突变体的血液和蚕茧无色的原因可能是类胡萝卜素的转运与细胞吸收缺陷而引起的。Sakudoh等4对CBP在前胸腺的表达分析研究中，分离鉴定了一种新的类胡萝卜素结合蛋白BmStartl,BmStartl基因与CBP正向同源，在家蚕黄、白茧品种中均有表达。随着后基因组时代即功能基因组时期的来临，蛋白质组学(Protoemics)的应用越来越受到重视5,6。自从1994年Wi1kins和Wi11iams第一次提出蛋白质组(Pr。te。me)的概念以来，蛋白质组学的研究得到了空前的发展，相关技术的研究也取得了重大突

8、破7,8o家蚕蛋白质组的研究，科学工作者正以家蚕胚胎、丝腺、血液等组织器官为材料，采用双向电泳分离技术、质谱分析等鉴定技术，开展功能蛋白的探索研究，构筑参考图谱和家蚕蛋白质数据库，查找与生长发育有关的功能蛋白，从而在蛋白质水平上阐明家蚕生长发育、代谢调控等生命活动的规律。与原核生物、酵母、人类的蛋白质组学研究相比，家蚕蛋白质组学还处在发展的初期阶段。为进一步探索家蚕有色茧的形成机制，我们利用双向电泳技术对结黄白茧的家蚕幼虫的黄、白血液蛋白进行电泳图谱的差异分析，查找与茧色素相关联的蛋白。1材料与方法1.1材料供试家蚕品种：Y92（黄白茧色限性品种），雌蚕黄血结黄茧，雄蚕白血结白茧，由华南农业大

9、学蚕丝科学系提供。1 .2材料处理常规饲养Y92品种至4龄期，从4期开始，每天腹足取血，在血样本中加入微量苯基硫月尿防氧化，10000r/min,4C离心20min,取上清，按Bradford法测定蛋白质含量，分装后置于-80C保存。等电聚焦电泳前，根据所测蛋白质含量，将血液与裂解液适当比例混合，冰上裂解1h,12000r/min,离心30min,取上清备用。本文为全文原貌未安装PDF浏览器用户请先下载安装原版全文1.3双向电泳分析第一向等电聚焦电泳（IEF）使用IPGphorII等电聚焦仪，参照仪器使用说明书进行操作，使用18cm,pH值310的IPG干胶条，300区g上样量；第二向SDSP

10、AGE使用12%的分离胶，电泳后的凝胶，参考Yan等9的方法进行银染。双向电泳图谱利用AmershamPharmacia公司的ImageMasterTM2DPlatinum5.0软件进行分析，按照说明书操作。2 .4质谱鉴定委托上海中科新生命生物技术有限公司采用电喷雾串联质谱(ESI-MS-MS)进行蛋白质检测分析。2结果与分析3 .1幼虫4、5龄期黄血、白血蚕的血液蛋白含量变化为了解Y92品种4、5龄期黄血、白血幼虫体血液蛋白含量的变化情况，从4龄第一天开始，测定各天血液蛋白质含量，结果见图1O从图1可知，Y92幼虫4、5龄期血液蛋白质含量随生长发育逐渐增多，5龄第八天到达最高值，黄血蚕94

11、.36止g/止L,白血蚕54.82黄、白血幼虫体中的血液蛋白质含量在5龄第五天后逐渐变大，第八天达到最大，黄血蚕血液蛋白质含量高出白血蚕39.542.2双向电泳分析家蚕Y92幼虫5龄第六天黄血蚕（雌）、白血蚕（雄）的血液蛋白样品经双向电泳分析和银染法染色，其图谱如图2所示。UlmageMasterTM2DPlatinum5.0软件分析，在图2的黄血蚕、白血蚕5龄幼虫的血液蛋白中共检测到507个蛋白点，其中黄血蚕蛋白点287个，白血蚕蛋白点220个，相互能匹配的蛋白点有205对，匹配率为80.9%;特异性蛋白点黄血蚕有82个，白血蚕有15个，具等电点和分子量列于表1、表2。从表1和表2的结果看，

12、黄血蚕特异性蛋白，分子量在1029.9kD的占了总数的13.41%;3049.9kD的占了总数的23.17%;70-89.9kD的占了总数的39.02%;90kD以上的占了总数的19.51%。白血蚕的15个特异性蛋白点，分子量的大小在1099kD。在特异蛋白中，黄血蚕和白血蚕蛋白的等电点绝大多数分布在4.09.5。对黄血、白血相配匹配的205对蛋白，经比对分析，黄血蚕血液蛋白含量为白血蚕3倍及以上的匹配蛋白点有48对（表3）,差异3.04.9倍的有26个；5.06.9倍的有9个；7.08.9倍的有3个；9.0倍以上的有11个。而白血蚕血液蛋白含量大于黄血蚕3倍以上的匹配蛋白点却只有18对（表4

13、）,差异3.04.9倍的有11个；5.06.9倍的有2个；7.08.9倍的有2个；9倍以上的有2个。2.3黄血特异蛋白点的ESIMSMS鉴定分析通过从分析黄血蚕与白血蚕的双向电泳图谱（图2）,我们发现黄血特异蛋白点中的2540号是一个白血蚕没有的、且容易提取的特异蛋白，于是将该蛋白提取送上海中科新生命生物技术有限公司用电喷雾串联质谱（ESIMSMS）进行质谱分析，图谱如图3所示。质谱分析得到5段肽段序列，分别为：VFGTLGQNDDGLFGKEIFNDDRGKLTGQAYGTRVLGPAGDSTNYGGRNAEAAIDINRSGMTATGSGVWDLDKNTRLSAGGMVSKRPDVGVQA

14、EFR对以上序列，经与Insecta和Oryzasativa蛋白数据库的相关蛋白进行比对，与gloverinlikeprotein4Bombyxmori,在NCBI数据库中的登录号为5242121有95个氨基酸相匹配，匹配率为55.56%。3讨论家蚕茧色素物质的形成，是幼虫期蚕体从摄取的桑叶物质中转化而成，因而，蚕结黄茧还是白茧，茧色的表现如何，除了遗传基因起决定作用外，桑叶中的叶黄素、黄酮类化合物等色素物质能否被消化吸收，透过肠膜进入血腔再进入绢丝腺中，透过性便是一道屏障10o根据我们对Y92血液的颜色观察，从3龄幼虫期的脚色便可观察出雌雄血液的颜色差异（雌黄血、雄白血），表明叶黄素、黄酮类

15、化合物等色素物质已经在蚕体的血腔中形成，由此推测，色素物质在3龄前已经合成或桑叶中的色素物质经蚕体消化吸收进入到了血腔中。从血液总蛋白含量的测定结果看，大蚕期的幼虫由于食桑量多，代谢旺盛，能大量将桑叶中的营养物质通过消化吸收，透过中肠肠壁进入血腔后合成蛋白质，使体内血淋巴的蛋白质含量逐渐积累性增多，到成熟前的第二天（5龄经过第八天），血液中的蛋白质含量最高，黄血蚕94.36白血蚕54.82黄血蚕与白血蚕的血液蛋白含量出现了较大的差别，此原因可能是黄血蚕（雌）的性腺旺盛发育，代谢比白血蚕（雄）大而产生的。家蚕在眠期，由于不食桑叶，而体内却进行着蜕皮的生理代谢，仍需大量消耗能量，此时血淋巴中的一部

16、分蛋白质就会被转化为能量物质而消耗掉，故4龄期蚕和5龄期蚕时的血液蛋白含量均相对较低。蚕体吐彩色茧丝的生理生化机制，目前国内外的研究报道不多，主要的报道有胡萝卜素、叶黄素从血淋巴到中部丝腺的的转运过程中，可能通过色素结合蛋白而实现在蚕体内的转运代谢的1-3oJ1n等11用双向电泳和计算机辅助分析方法发现一些蛋白高丰度地表达在家蚕黄茧限性品种的中部丝腺中，推测这些蛋白可能与家蚕茧色形成相关，本文利用双向电泳的图谱，比较分析了Y92黄血蚕与白血蚕蛋白的差异，特异蛋白方面，雌（黄血蚕）比雄（白血蚕）多，黄血蚕有82个，白血蚕有15个。相互匹配的蛋白点有205对，占能检测到的80.9%;但其量值仍有较

17、大的差别，黄血蚕有较多高丰度蛋白的表达，黄血蚕大于白血蚕34倍的蛋白点有26个，9倍以上的有11个。白血蚕大于黄血蚕34倍的蛋白斑点只有11个，9倍以上的有2个。这一现象是否暗示了同一类别的蛋白，在不同血色或雌雄间可能表达着不同的活性与功能。至于两者之间存在着怎样的相互作用机制，以及这些蛋白在茧色素物质的代谢中起着怎样的作用，今后还需要更多的研究来揭示。本试验虽然研究了家蚕茧色限性品种Y92幼虫4、5龄期血液蛋白的代谢变化规律，运用蛋白质组学的技术探讨了血液蛋白组分的差异表达，然而家蚕的茧色调控机制却非常复杂，有关色素在蚕体内的合成与转运机制仍有待我们今后继续研究。1 JOUNIZE,ANDM

18、A.PurificationandpartialcharacterizationofaluteinbindingproteinfromthemidgutofthesilkwormBombyxmoriJ.JBiolChem,1996,271(25):14722-14726.2 TABUNOKIH,SUGIYAMAH,TANAKAY,etal.Isolation,characterization,andcDNAsequenceofacarotenoidbindingproteinfromthesilkglandofBombyxmorilarvaeJ.JBiolChem,2002,277(35):3

19、2133-32140.本文为全文原貌未安装PDF浏览器用户请先下载安装原版全文3TSUCHIDAK,C.KATAGIRI,TANAKAY,etal.ThebasisforcolorlesshemolymphandcocoonsintheYgenerecessiveBombyxmorimutants:adefectinthecellularuptakeofcarotenoidsJ.JInsectPhysiol,2004,50(10):975-983.4 SAKUDOHTK,TSUCHIDA,KATAOKAH.BmStartl,anovelcarotenoidbinding proteinisof

20、orm fromBombyxmori,isorthologoustoMLN64,amammaliancholesteroltransporterJ.BiochemBiophysResCommun,2005,336(4):1125-1135.5 KAHNP.Fromgenometoproteome:lookingatacellproteinsJ.Science,1995,270(5235):369-370.6 WILKINSM,SWINBANKSM,SWINBANKSD.GovernmentbacksproteomeproposalJ.Nature,1995,378(6558):653.7 AEBERSOLDR.AmassspectrometricjourneyintoproteinandproteomeresearchJ.JAmSocMassSpectrom.,2003,14(7):68568 TYERSM,MANNM.FromgenomicstoproteomicsJ.Nature,2003,422:193