蛋白质组学整理——修改版

1、第1章 绪论 (名词解释8个5分 简答3个十分 论述2个15分)名词解释：1. 蛋白质组：指的是由一个细胞、一个组织或是一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。2. 蛋白质组学：旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式和功能模式，其内容包括蛋白质的表达与存在方式（修饰方式），结构与功能，以及各个蛋白质之间相互作用等。3. 可变剪接：是指同一基因转录形成的RNA前体可经过一种以上剪接方式产生多种不同的mRNA的过程。可将同一基因中的外显子以不同的组合方式来表现，使一个基因在不同时间、不同环境中能够制造出不同的蛋白质。从而使蛋白质组的复杂性远远高于基因组。4. 蛋白质翻译后修饰（PT

2、M）：是指对新合成的多肽链或蛋白质进行的化学修饰，主要是磷酸化、糖基化、酰基化、硝基化、磺基化、脂化、泛素化和水解修饰等。使数量有限的编码基因产生数量巨大的蛋白质。简答题：1. 基因组与蛋白组的区别与联系（1） 同一性与多样性：同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的；对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的（2） 有限性与无限性：基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，对基因组序列的测定是一种“有限”的工作；由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的

3、确定是一种“无限”的工作。（3） 静态与动态：一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的。（4） 周期性与空间性：基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。2. 重点：基因组与蛋白组的区别与联系： 区别/联系基因组蛋白质组同一性与多样性同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是

4、一样的；对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下，蛋白质组的构成是不同的。有限性与无限性基因组无论大小，其核苷酸的数量和序列是一定的，例如人类基因组长度为32亿个碱基对；对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰基化等，很难确定蛋白质组的蛋白质数量；对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。静态与动态一个个体的基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变；个体的蛋白质组，作为新陈代谢的主要执行者，在个体的生命活动中却总是变动的。周期性与空间性基因组通常位于细胞核内，比较稳定，序列和功能一般不受空间的影响，但是在发育的不同阶段和不

5、同的细胞周期，mRNA的表达是不一样的；不同的蛋白质分布在细胞的不同部位，它们的功能与其空间定位密切相关；许多蛋白质在细胞内不是静止的，他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。孤立作用与相互作用基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不干扰；蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用。单一手段与多种技术在基因组研究中，DNA测序技术是最基本和最主要的工具，因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务；在蛋白质组研究中，需要的研究技术远远不止一种，并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术。第2章 蛋白质概述名词解释：1. 等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离

6、成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。2、蛋白质是一切生物体中普遍存在的，由20种左右天然-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物；简答题3、氨基酸的分类、光学性质、重要化学反应1）非极性（疏水性）氨基酸(8种）A丙氨酸Ala、V缬氨酸Val、L亮氨酸Leu、I异亮氨酸Ile、F苯丙氨酸Phe、W色氨酸Trp、M甲硫氨酸Met、P脯氨酸Pre2）极性（亲水）中性氨基酸7种 G甘氨酸Gly、S丝氨酸Ser、T苏氨酸Thr、C半胱氨酸Cys、Y酪氨酸Tyr、N天冬酰胺Asn、Q谷氨酰胺Gln3）碱性氨基酸3种 H组氨酸His、K赖氨酸Ly

7、s、R精氨酸Arg4） 酸性氨基酸 D天冬氨酸Asp、E谷氨酸Glu2、光学性质1）除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，这其四个不同的取代基可有两种不同的空间排列方式，L型和D型。它们具有相反的旋光性，也称分子手性。 蛋白质分子中的氨基酸一般为L型。2）参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区（220-300nm）显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为279、278、和259nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。3、重要化学反应1）与茚三酮反应:用

8、于氨基酸定量定性测定.2）与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应（sanger反应），用于蛋白质N-端测定.3）与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应），用于蛋白N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。（初级蛋白质测序）除脯氨酸与羟脯氨酸外，可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。第3章 蛋白质样品的制备可能会出论述题：蛋白质样品的制备包含蛋白质分离、提取与纯化3个过程。简答题：1. 样品制备的原则（1）全息性，尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失，尽可能获得所有的蛋白质。（2）应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方

9、法应具有可重现性。（3）细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。（4）防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。（5）样品裂解液应该新鲜配置，并且分装冻存于-80 。勿反复冻融已制备好的样品。（6）通过超速离心清除所有的非蛋白杂质，尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。（7）防止发生人为的蛋白质样品化学修饰，如加入尿素后加温不要超过37 ，防止氨甲酰化而修饰蛋白。2.制备流程分为组织活细胞破碎、分离或沉淀蛋白质、纯化蛋白质。后两步往往是结合在一起进行的。1) 组织活细胞破碎的原则是，在整个过程中最大限度的限制蛋白质的水解和其他形

10、式的蛋白质降解。2) 沉淀溶液样品中的蛋白质，清除杂质是可选择的步骤，主要依赖于样品本身和研究目的，通常建议采用最简单的样品制备方法。3) 蛋白质的纯化是对沉淀的蛋白质进行再溶解，重复沉淀的过程，通常利用冲泡胀溶液稀释样品。样品破碎与分离蛋白质3.组织与细胞破碎（一）温和的裂解方法通常应用于组分比较简单的样品，例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。（二）剧烈的蛋白裂解常用于难于破碎的细胞，如固体组织内的细胞，或具有坚硬细胞壁的细胞，如酵母细胞，这种方法可以使细胞完全破碎裂解。4、蛋白质沉淀这是一种可选择的方法。

11、如果样本十分重要， 想得到完整而精确的样本蛋白质谱， 应避免使用沉淀和重溶的方法。蛋白质裂解5、裂解液（各组分及其作用）组成成分及作用： 离液剂：通过改变或破坏溶液中的氢键等次级键使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。尿素是常用的离液剂。 还原剂：还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键，让大多数蛋白完全展开，增加蛋白的溶解性。 表面活性剂：表面活性剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用，以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。（4）起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其

12、处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。样品预分级6.分步裂解提取 1.目的与原理 由于蛋白质在细胞中存在部位不同，而不同蛋白质的溶解性亦不相同，为了提高双向电泳的分离效果，有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。 2.方法：分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。第一步裂解液只含有40mmol/L Tris，其余为去离子水，只溶解偏亲水性的蛋白。第二步裂解液属传统的裂解方法，含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分，由于具有良好的溶解能力，可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白。第三步裂解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分，如表面活

13、性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea，主要溶解偏疏水性的蛋白。在多数情况下，大部分蛋白质在第一步和第二步中可被提取。清除影响电泳的图谱的杂质样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量，因此，在样品制备中需考虑清除这些杂质。第四章 蛋白质分离技术1. 双向凝胶电泳（2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。基本原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。2. 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, P

14、AG）是通过丙烯酰胺（acrylamide）单体和双功能团交联剂如N,N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylamide）按一定的比例混合，在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构，使其产生分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶的优点 机械强度高，弹性好，透明，无电渗作用，吸附作用极小； 化学性质稳定，与待分离的物质不起任何化学反应； 样品不易扩散，用量小； 凝胶孔径可通过改变单体和交联剂浓度调节 分辨率高。3、IEF原理等电聚焦电泳（IEF）是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。所以利用等点聚焦技术分析的对象

15、只限于蛋白质和两性分子。分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所带净电荷为零的点移动。 这就是等电聚焦效应。1）pH梯度的形成在电场下载体两性电解质的变化 天然pH梯度法：在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。所有载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零。 引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。2）pH梯度的形成

16、过程 pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定。一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm，凝胶的厚度为1mm，使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成，2小时后无多大变化,如图3）载体两性电解质的缺点n利用了合成载体两性电解质（SCA）来生成pH梯度，合成过程复杂，重复性小。nSCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移，难以固定在IEF胶内，由于水合正离子引起的电渗流导致阴极漂移现象，是pH的不稳定性增加。n负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响很大。3. 固相pH梯度(IPG)原理：它利用一系列具有弱酸或弱碱的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形

17、成pH梯度，然后将其共价键合在介质上，成为凝胶介质的一部分，从而形成固定的，不随环境电场等条件变化的PH梯度。4. SDS-PAGE电泳：原理：1）蛋白质分子解聚成亚基，解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。 2）缓冲系统的选择：一般来说，在被分析的蛋白质稳定的PH范围，凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用。 3）凝胶浓度的选择：由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度，只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。不同分子质量范围的蛋白质应选

18、用不同的凝胶浓度。5. 双向电泳的局限性：(1) SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。(2) 疏水性蛋白质因不能溶于SDS而不适合作2-DE；PI值<3或>11的蛋白质；分子量过大或过小的蛋白质；低丰度蛋白质<1ng，都很难被检测到。(3) 样品上样量相对少，使检测的灵敏度受到限制。(4) 电泳结果需经染色处理，不能直接分析，不同蛋白质与染料的结合差异较大。(5) 不能高通量分析，且耗时。(6) 目前尚不能实现完全自动化处理。第六章 层析技术名词解释：1、 层析法基本原理层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等）

19、，使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。吸附层析技术包括吸附柱层析、薄层层析、聚丙烯酰胺层析和疏水层析等。2、 吸附柱层析层析的原理： 利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解度的差异进行分离。3、 薄层层析(Thin layer chromatography)采用的机制及按固定相的分类薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。薄层层析可根据固定相的种类分为吸附薄层层析（吸附剂为固定相） 、分配薄层层析（固定在支持剂上的水溶液或有

20、机溶剂为固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂为固定相）等。4、 聚酰胺薄膜层析的原理： 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键，对极性物质有很强的吸附作用。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。 被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱，确定了吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，选用适当的展层溶剂，使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程，形成一个分离顺序，彼此分开。5、 疏水层析的原理： 在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下，蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用

21、而被吸附。淋洗液的离子强度降低，蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。即高盐浓度吸附，低盐浓度洗脱。6、 分配层析技术原理 利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。固定相液体均匀覆盖于载体表面，流动相流过固定相。7、 凝胶过滤层析原理 凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。8、 离子交换层析的原理原理：是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的离子与交换剂上

22、的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 。 9、 亲和层析原理利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂；激素和受体等。10.高压液相层析分类正相色谱法：共价结合到载体上的集团都是极性的基团，流动相的极性比固定相的极性弱；在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。反相色谱法共价结合到载体上的基团是一些直链碳氢化合物，流动相的极性比固定相的极性强。在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 第七章 生物质谱技术和蛋白质鉴定名词解释：1. 软源：离子化能量

23、低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子离子峰，即得到分子量信息。 硬源：离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息。2. 质谱图：以质荷比m/z为横坐标，以对基峰(最强离子峰，规定相对强度为100%)相对强度为纵坐标所构成的谱图。3. 生物质谱技术1） 衰变A. 源内衰变技术（in source - decay，ISD ），发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后的几百纳秒之内，是离子的“即刻片段化”。可以通过线性时间飞行质谱中检测到；可用于鉴定蛋白质；B. 源后衰变技术：样品分子首先发生离子源内活化，在激光照射的第一秒内发生解吸附的离子与基质之间会发生低能碰撞，使样品离子

24、活化，进入第一级无电场漂移区时有可能发生裂解。这一过程发生在源内离子化之后，被称为源后衰变。2）碰撞诱导解离：是通过惰性气体撞击，使得多肽的肽键断裂的过程。大分子肽延肽链在酰胺键处断裂成肽离子片段，电荷保留在N端的碎片上定名为a,b,c离子；电荷保留于C端的碎片上时称之为x,y,z离子。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子。3）串联质谱：串联质谱主要由离子源、多级质量分析器及碰撞室组成。第一级质量分析器起质量过滤器作用，即从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子进入碰撞室，母离子在高速惰性气体碰撞诱导解离产生碎片即子离子，由第二级质量分析分析子离子的质荷比。通过分析母离子与子离子的

25、质量，研究二者关系及母离子的裂解规律，可以获得母离子的结构信息。4、肽质量指纹谱PMF：是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其肽质量指纹图也具有特征性。5、肽序列标签（ peptide sequence tag，PST ）由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。数据库检索鉴定蛋白质时，可用读出的部分氨基酸序列，结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查询，对肽段进行鉴定。简答题：1. 电喷雾电离原理：样品溶解在溶剂中，溶液从毛细管流

26、出时,在电场及辅助气流作用下喷成雾状的带电微液滴,在加热气体作用下,液滴中溶剂被蒸发,导致液滴直径逐渐变小,表面电荷密度增加。当表面电荷产生的库仑排斥力与液滴表面张力大致相等,液滴炸碎,产生带电的更小微滴;这些液滴中溶剂再蒸发，重复直至样品以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相。这些样品离子通过锥孔、聚焦透镜进入质谱仪分析器后被检测。优点：测定分子质量高；灵敏度极高（10-15mol）；软电离，可观察生物分子非共价反应；易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液；没有基质干扰；适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析；带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子，通过计算

27、平均值给出更精确的质量数；特别适于测多肽的修饰；样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。缺点：耐盐能力低；对某些化合物特别敏感，污染难清洗；样品需先气化；带多电荷，在分析混合物时，产生混乱；定量时需内校准。2. 基质辅助激光解析电离：原理：MALDI 是将样品均匀包埋在固体基质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。离子化后的分子被电场加速进入飞行时间质量分析器而被检测。基质在MALDITOF MS的方法中的作用主要是从激光脉冲中吸收能量并使被测分子分离成单分子状态。优点：质量数可达300,000Da；10-15 至10

28、-18级灵敏度；软电离方式，无或极少碎片离子；耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）；适于分析复杂混合物。缺点：分辨率低；1000Da以下基质峰干扰；激光解吸附离子化有可能使样品光降解；不能分析非共价键相互作用；定量时需要内校准；如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。MALDI 的进样是固相方式，不像ESI的液相进样容易受溶液性质的影响，因此对杂质的忍耐性较好。3、3. 飞行时间质量分析器为什么加离子镜反射？即增加了一个反射电场，起到能量聚焦作用，使质量相同能量不同的离子进入反射器后，能量大的离子速度快，但走的距离远，能量小的离子速度慢，但走的距离近，经过反射后，二者同时到达检测器，这样就消除了由于能

29、量分散造成的分辨率降低；且离子改变了飞行方向，延长了飞行距离，提高分辨率和准确度。4. 串联质谱测定多肽序列的原理：多肽碰撞诱导解离时的碎裂作用优先发生在酰胺键上,生成专一的序列离子。电荷保留在N端的碎片上定名为a,b,c离子；电荷保留于C端的碎片上时称之为x,y,z离子。y、b系列相邻离子的质量差，即为氨基酸残基质量，根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨基酸的序列。第八章 蛋白质功能研究蛋白质相互作用研究策略和方法（一）生化方法GST（谷胱甘肽巯基转移酶） pull-down assay，亲和印迹，免疫共沉淀，化学交联，荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energ

30、y Transfer （FRET），表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)，生物传感器技术（Biosensor）1.GST pull-down assay基本原理 细菌表达的谷胱甘肽s转移酶（GST）融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化，也可以将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间

31、的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用 2. 亲和印迹 蛋白质用PAGE胶分离后，转移到硝酸纤维素膜上，然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。3. 免疫共沉淀 在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的固化于Agarose珠上的Protein A或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白兴趣蛋白抗兴趣蛋白抗体Protein A或G”，通过离心分离，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。4、化学交联使用一种交联试剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂耦联到

32、一蛋白质上，耦联体与抽提物温育在一起。如果抽提物中的A蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，用光激活后交联剂的一部分就结合到A蛋白上。加入还原剂，切割交联试剂，使A蛋白上带有交联剂上有标记的部分，然后用凝胶电泳等方法分析蛋白质。5.荧光共振能量转移（FRET） FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象，它指的是当一个荧光分子（及供体）受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团（即受体）转移的过程。但仅当受体和供体的距离小于10nm，且激发光谱相重叠时，FRET才能发生。并且随着光谱重叠的增加，FRET的效率将提高，同时FRET可能发生的距离也将增加。将两蛋白质分别使用CFP/YFP(或BFP/GFP)标记

33、，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到FRET发生，则证明两蛋白质间距离小于10nm，存在相互作用。5. 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)当光从光密介质入射到光疏介质时（n1>n2）就会发生全反射现象，产生沿X轴方向传播而振幅衰减的一个波，即消逝波。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使得反射光的能量急剧减少。（二）分子生物学方法酵母双杂交系统、噬菌体展示技术« 酵母双杂交酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞转录因子，特别是酵母转录因子

34、GAL 4 性质的研究。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。转录激活因子在结构上是组件式的，往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有N 端的DNA 结合结构域(DNA binding domain，简称为BD) 和C 端的转录激活结构域(activation domain，简称为AD) 。BD可识别DNA 上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游 ；AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。当两者独立存在时, 无转录激活功能；但两者只要相互接近, 即可激活转录。酵母双杂交系统三个组成部分1 ）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白（

35、bait）；2 ）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为猎物或靶蛋白（prey）；3 ）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等；有GAL4系统和LexA系统。酵母单杂交DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合，调控报道基因的表达，研究DNA与蛋白质的相互作用。酵母三杂交主要特征：蛋白X与Y的相互作用通过第三个分子蛋白Z的参与实现目的：研究两个蛋白质与第三个成分间的相互作用，按第三个成分的不同，可以是蛋白质、RNA 或小分 子药物反向双杂交反向双杂交系统（Reverse two hybrid system）特点：反选择筛选策略

36、原理： URA3编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质。URA3基因的启动子内引入Gal4的结合位点。改造的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上，只有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活URA3基因的表达才能生长。在含有5-FOA的完全培养基上 ，“诱饵”和“猎物”的相互作用则抑制细胞的生长。然而如果目的蛋白，即与BD或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用，URA3基因不表达，则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长。« 噬菌体展示技术噬菌体展示技术能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，进而通

37、过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，为筛选到目的蛋白或多肽奠定了基础。优点：直接得到基因；高选择性筛选复杂混合物；直接评价蛋白质结合特异性原理：噬菌体展示技术是将待筛选的蛋白质插入到噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因8 或基因3 之间，构建成融合蛋白噬菌体文库，表达的融合蛋白呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链。利用目的蛋白与特定配基结合后，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质与编码遗传信息之间提供了直接的物理联系。该技术的显著特点是建立了基因

38、型和表现型之间的对应关系。三个基本因素：1. 在噬菌体p和p衣壳蛋白N端插入外源待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别。2. 利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（淘洗，panning），从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。3. 外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来。噬菌体展示技术的局限性：（1 ）在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有

39、不同序列分子的数量一般限制在109（2 ）不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。例如，在噬菌体展示文库试验中，由于部分未折叠的蛋白在细菌中很容易被降解，因此，必须小心控制条件，以保证在噬菌体表面展示的文库没有降解。另外，真核细胞蛋白在细菌中表达差，是因为它们的蛋白质合成与折叠机制不同的缘故。（3）噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。（4）由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。第九

40、章蛋白质翻译后修饰的鉴定这个章节，很可能会考，而且是论述题1、 名词解释：微观不均一性：糖蛋白存在着复杂的微观不均一性(microheterogencity)，即在蛋白质的氨基酸序列完全相同的情况下，由于糖链的组成或连接方式的不同而形成多种糖蛋白亚型。糖蛋白的这种复杂性在其生理功能上有其重要意义，但却给糖蛋白的分析带来了极大的困难。2、 N-糖苷键、 O-糖苷键N-糖苷键：N-糖基化通常是指糖链共价连接在蛋白质肽链上的天冬酰胺 (Asn) 残基的酰胺基、N-末端氨基酸残基的-氨基、赖氨酸或精氨酸残基的-氨基处。糖链与天冬酰胺残基的连接发生在三个残基的特殊识别序列 (Asn-X-Ser/Thr，

41、其中的X为除脯氨酸和天冬氨酸以外的任何氨基酸）处。O-糖苷键：通常是指糖链通过N-乙酰葡萄糖胺连接在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸残基侧链的羟基处。3、磷酸化蛋白质组研究策略（大题）一、磷酸化蛋白质的检测 1. 32P放射性标记法 2抗体免疫印迹检测法二、磷酸化蛋白质的富集策略 富集的策略应用在磷酸化蛋白质组研究中，有两种不同的应用阶段，包括富集磷酸化蛋白质和富集磷酸化肽段。1磷酸化蛋白质的富集 磷酸化蛋白质抗体 这是目前富集磷酸化蛋白质的主要手段。 化学修饰2磷酸肽的的富集策略(1) 反相液相色谱(RP-HPLC)分离磷酸肽(2) IMAC分离富集磷酸肽 固相金属亲和色谱（imm

42、obilized metal affinity chromatography IMAC)最初用于纯化含组氨酸的蛋白质，现在常被用于选择性地富集磷酸化肽段，对磷酸化蛋白质的富集无效。 磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，可选择性地亲和提取磷酸化肽段，在碱性环境下或有磷酸盐存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸化肽段被洗脱。(3) 磷酸基团亲和取代三、磷酸化肽段的鉴定 1. MALDI-TOF-MS结合磷酸酶水解分析法，这是蛋白质磷酸肽鉴定的常用手段。2.串联质谱鉴定四、磷酸化氨基酸位点的确定 要确定其磷酸化位点，需要用串联质谱产物离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。五、蛋白质磷酸化的定量分析

43、(1) 15N稳定同位素标记法(2)同位素标记的亲和试剂第十章 蛋白质组学定量技术名词解释：1、 细胞培养氨基酸稳定同位素标记（SILAC）：基本原理 分别用天然同位素(轻型、中型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸，主要是Lys和Arg，取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级质谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。（在培养基设计时，该必需氨基酸必须是添加

44、到培养基当中的。）2、 .荧光差异凝胶电泳 DIGE 简介：2 -D DIGE是一种在2-D 电泳之前标记蛋白样品的一种方法，可以对样品间蛋白丰度的差异进行精确分析。有两类提料可供选择Cy2、Cy3、Cy5最小标记染料，以及Cy3、Cy5 饱和标记染料，它们的分子量和电荷匹配，因而标记不同CyDye DIGE 染料的同一种蛋白将迁移到2 -D胶的同一位置 。最小标记法染料 Cy2只对样品中的少量蛋白进行了标记，因此称为“最小标而法”，用在容易获得多量样品的常规2-D电泳。标记肽段中赖氨酸残基上的氨基，都带一价电荷，取代标记后不会改变蛋白等电点。饱和标记染料 Cy3、Cy5与蛋白半胱氨酸残基的巯

45、基基团共价结合。用于稀少样品标记。为了实现对半胱氨酸残基的最大化标记，标记时采用了荧光染料相对于标记蛋白的高比率，使得每一种蛋白的所有可能的半胱氨酸都进行了标记， 导致一个样品中蛋白质的大多数半胱氨酸基团都被标记。2-D DIGE内标：简答题：3.同位素标记亲和标签技术Isotope-coded affinity tag（ICAT）A: ICAT试剂结构:包括3个部分，亲和标签(生物素，biotin)，用来分离ICAT标记的多肽；连接子，用来整合稳定的同位素；活性基团，用来特异结合巯基(半胱氨酸)。试剂具有两种形式：重型（含8个氘）和轻型（含8个氢）。B: ICAT标记定量技术流程：来源不同处

46、理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂专一标记Cys，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。o优势: 1.将混合样品(来自正常和病变细胞或组织等) 直接测试；2.快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质、尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；3.快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质) 及生物标志分子,进而快速用于疾病诊断；4.能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组织中绝大部分蛋白质； 5.烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸胍等)存在下都可进行； 6.只需分析含Cys残基的肽段，从而降低了蛋白质混合物分析的复杂性； 7.ICAT允许任何类型的生化、免疫、物理的分离方法，因此能很好地定量分析微量蛋白质。ICAT法的缺点： （1）它不能用于标记不含半胱氨酸