等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V617F突变讲解

1、等位基因特异性-PCR联合限制性内切酶消化法检测JAK2V6仃F突变08-12-07 09:18:00 编辑：studa20匡I习作者：申徐良 陈方平 魏 武 张梅香 史文芝秦小琪徐洪亮【摘要】目的：建立敏感特异的JAK2V617F点突变的临床检测方法。方法：基因组DNA从 HEL细胞或正常志愿者外周血中提取。采用等位基因特异性 -PCR(Allele specific-PCR ，AS-PCR和限制性内切酶消化的方法检测基因组中 JAK2V617F突变。结果：本 AS-PCF法可对JAK2基因扩增出364 bp的内参照条 带，当存在JAK2V617F突变时，又可以扩增出203 bp的突变条带。

2、只有野生型 内参照条带364 bp可被BsaXI消化切害叽结论：AS- PCF法和限制性内切酶法 是检测JAK2V617F突变的敏感特异的检测方法，可以成功应用于临床检测。【关键词】等位基因特异性-PCR JAK2V617F突变；限制性内切酶BsaXIAbstractObjective:To establish a sen sitive and specifictest for JAK2V617F poi nt mutati on. Methods: Geno mic DNA was isolated from HEL cells or Peripheral-blood cells from

3、no rmal volun teer. Allele-specific polymerase cha in reacti ons (AS-PCR) and restrictio n en zyme digesti on were performed to detect the mutatio n in geno mic DNA.Results:A control ban d(364 bp) can be obta in ed by AS-PCR,a nd a muted ban d(203 bp) can be obta in ed only whe n JAK2V617F was prese

4、 nted. Only wildtype con trol ban d(364 bp) can be digested by restriction enzyme BsaXI .Conclusion:AS -PCR and restriction enzymedigestio n were sen sitive and specific tests for JAK2V617F point mutati on, and can be successfully used for cli ni cal test.Key wordsAllele specific-PCR;JAK2V617F mutat

5、io n;Restrictio nen zyme BsaXIJAK2 基因属 JAKs(Janus kinases/Just another kinases )家族成员，是胞浆非受体性酪氨酸激酶，在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关 键作用1。2005年，Baxter 2和Kralovucs 3先后发现大部分骨 髓增殖性疾病患者携带有一个获得性的JAK2基因突变-JAK2V617F,该基因突变位于JAK2基因第1 849位，原来的鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，导 致原位于617位的缬氨酸错义编码为苯丙氨酸(G -T, JAK2V617F)。该突变的 阳性率在PV中高达65%- 97%

6、ET为23%- 57呀口 IMF为35%-57% 在AML/CML中有少量表达26。JAK2V617F基因突变的发现是近年来骨髓增 殖性疾病发病机制的突破性进展，因此有学者将其称为骨髓增殖性疾病的“JAK2时代”。JAK2V617F勺发现对于临床上骨髓增殖性疾病的诊断和鉴别诊 断有非常重要的意义。为此，我们在临床上建立了两种敏感特异的 JAK2V671F 点突变的检测方法等位基因特异性 PCRt(Allele specific-PCR , AS- PCR和限制性内切酶消化法。这两种方法的应用，有利于提高骨髓增殖性疾病 的临床诊断水平。1 材料与方法1.1 细胞培养HEL细胞株购自中国科学院上海

7、科学研究院，培养于含10%台牛血清(Hyclone)、100 U/mL 青霉素，100 U/mL 链霉素的 RPMI1640(Gibco)培养基 中，置于37 C、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每 3 d换液一次。待细胞 生长至80%匚合时以1 ：3的比例传代，取对数生长期的细胞用作实验。1.2 基因组DNA制备HEL细胞基因组和正常人血液基因组 DNA用血液基因组提取试剂盒(上 海生物工程公司产品)提取。1.3 AS-PCR及产物分析PCR引物合成工作由北京奥科生物公司完成。各引物序列如下：公用反 向引物(R1)5 ' -CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTC

8、野生型正向引物 (F1)5 ' -ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAGAAA64 bp)、突变特异性正向 弓 I物(F2) 5 ' -AGCATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT03 bp )。PCR反应体 系为50卩L,每管中加入80 ng DNA模板，公用反向引物(10卩M)1卩L，突变特异性正向引物(10卩M) 1卩L或野生型正向引物(10卩M) 1卩L，10X PCF缓冲液 5 卩 L，25 mM MgCI23 卩 L， 10 mM dNTPs 1 卩 L，5 U/ 卩 L 的 Taq 聚合酶1卩L,最后用去离子水补足50卩L。置于MJ

9、Research PTC-100基因 扩增仪中按以下程序扩增：先94 C变性11 min,然后进行扩增循环，包括变 性 40 s (94 C)、退火 1 min (54 C)、和延伸 1 min (72 C),扩增 35 循环，最后72 C延伸10 min。 AS-PCR物经2.0%琼脂糖凝胶(含EB)电泳 鉴定，应用AlphaEaseFC凝胶成像处理系统观察并分析结果。1.4.JAK2V617 F的限制性内切酶酶切鉴定BsaXI限制性内切酶为NEB公司产品。酶切反应体系：PCR产物20 卩L，NEB Buffer 4 4 卩L，BsaXI 1卩L (2U)，去离子水15卩L,总体积 40卩L

10、，37 C温育4 h。酶切完毕后于2%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。2 结果HEL细胞株是人红白血病细胞株，有学者6证实HEL细胞为 JAK2V617F基因突变的纯合子。因此，在本实验中我们以HEL细胞作为一个已知的含有JAK2V617F突变的的阳性标本，用于建立 JAK2V617F突变的检测方 法。AS-PCF过程中野生型正向弓I物(F1)5 ' -ATCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAG AAAG3'和公用反向引物(R1)5 ' -CTGAATAGTCCTACAGTGTTTTCAGTTTW 位于基因组上该突变位点的上游和下游，扩增产物为 364 bp ，该扩增作为 AS- PCR的阳性对照，用于检验基因组 DNA提取的质量和PCR体系的正确性。无论 基因组中是否存在JAK2V617F突变，只要提取的基因组 DNA完整，PCR体系正 确，这两条引物都可以扩增出364 bp的产物。突变特异性正向引物(F2) 5 '- agcatttggttttaaattatggagtatat针对突变位点设计的突变弓I物，该弓I 物3'端包含2个错配的核苷酸。当基因组中存在 JAK2V617F突变时，该引物 与公用反向引物(R1)可以扩增出203 bp