(分子生物学本科生课件)分子生物学相关技术-2014本科

1、( (分子生物学本科分子生物学本科生课件生课件) )分子生物分子生物学相关技术学相关技术-2014-2014本科本科l原核表达的已知蛋白l细胞裂解液中的未知蛋白质l应用cDNA文库，进行体外翻译的蛋白质文库中的未知蛋白l半定量检测蛋白与蛋白的亲和作用Protein Biochemistry Lab Nankai UniversityGST Protein XGST35S-labled cell lysate(glutathione-sepharose beads) (glutathione-sepharose beads)35S-labled cell lysateGSTProtein XGS

2、TGSTInteract at 40CMicrofuge to collect complexesProtein Biochemistry Lab Nankai University实实验验步步骤骤1 2 3autoradiographAnalyze by SDS-PAGELane1. MarkerLane2. GST-proteinXLane3. GSTGSTGSTProtein XProtein Biochemistry Lab Nankai University实实验验步步骤骤prepare proteinextract from brainmix and incubateexpress

3、 GST-fusionprotein in E.colipGEXGSTgene XProtein Biochemistry Lab Nankai UniversityProtein Biochemistry Lab Nankai UniversityGST-fusion proteinGST alone举 例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-GFPX-GFP + + +GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFPProtein Biochemistry Lab Nankai Universityl染色质免疫共沉淀一项研究细胞内蛋白质与染色质免

4、疫共沉淀一项研究细胞内蛋白质与DNA相互作相互作用的实验技术。其目的是确定特定蛋白是否结合于特定用的实验技术。其目的是确定特定蛋白是否结合于特定的基因组区域。的基因组区域。lChIP不仅可以检测体内反式因子与不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还的动态作用，还可以用来研究组蛋白的表观遗传与基因表达的关系。可以用来研究组蛋白的表观遗传与基因表达的关系。lChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：与其他方法的结合，扩大了其应用范围：CHIP与基与基因芯片相结合建立的因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；式因子靶基因的高

5、通量筛选；CHIP与体内足迹法相结合，与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-CHIP用于研用于研究究RNA在基因表达调控中的作用。在基因表达调控中的作用。 ChIP的基本原理是在活细胞状的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质态下固定蛋白质DNA复合物，复合物，并将其随机切断为一定长度范并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白或其复特异性地富集目的蛋白或其复合物结合的合物结合的DNA片段，通过对片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而目的

6、片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与获得蛋白质与DNA相互作用的相互作用的信息。信息。甲醛交联体内的DNA结合蛋白与DNA。超声破碎基因组DNA特异性抗体抗体结合 洗脱非结合DNA片段洗脱获得特异性结合DNA片段，用于检测l要研究基因的功能，基因的调控机制非常重要，基因的要研究基因的功能，基因的调控机制非常重要，基因的表达产物很复杂并难以准确的定量和定性。研究报告基表达产物很复杂并难以准确的定量和定性。研究报告基因系统成为一种简单的研究基因调控的方法。因系统成为一种简单的研究基因调控的方法。l对真核基因调控的了解，主要来自野生型和突变型的假对真核基因调控的了解，主要来自野生型和突变型的假定顺式作

7、用调控元件的活性测定实验，是在转染的真核定顺式作用调控元件的活性测定实验，是在转染的真核细胞中进行的。在大多数情况下不直接测定调控元件的细胞中进行的。在大多数情况下不直接测定调控元件的调节转录速率的能力调节转录速率的能力, ,而是把顺式调控元件与一种编码新而是把顺式调控元件与一种编码新的产物的的产物的, ,被称为报告基因的基因序列连接起来被称为报告基因的基因序列连接起来, ,在基因在基因的转录过程中的转录过程中, ,测定报告基因的转录产物的量测定报告基因的转录产物的量, ,来判断顺来判断顺式调控元件的调控能力。式调控元件的调控能力。 一般的报告基因需要满足以下几个条件：一般的报告基因需要满足以

8、下几个条件：基因被克隆并且已知全序列；基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；性物质；报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好；敏度高而且重现性好；细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测。报告基因的表达同样也不能影响或改变细检测。报告基因的表达同样也不能影响或改变细胞正常的生理活性。胞正常的生理活性。1.报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。用

9、或活性没有影响。 报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连检测基因序列相连, , 提取大肠杆菌中扩增的质粒提取大肠杆菌中扩增的质粒, ,转染入目的真核细胞中。与此同时还要将一有真转染入目的真核细胞中。与此同时还要将一有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒核启动子和增强子的另一种报告基因质粒, ,共转共转染同一细胞染同一细胞, ,以作为转染率的内对照。以作为转染率的内对照。 目前已有很多的方法用于报告基因的测定如目前已有很多的方法用于报告基因的测定如: : 比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免

10、疫法及原位染色法及流式细胞仪法。酶联免疫法及原位染色法及流式细胞仪法。荧光素酶荧光素酶(luciferase, luc)(luciferase, luc)报告基因报告基因 该酶克隆于北美洲萤火虫的荧光素酶基因,它能催化甲虫的荧光素的氧化性羧化作用,发射出光子,能被光度计或闪烁计数器捕获定量。 快速、方便,更具有很好的浓度线性范围(具有78个数量级的线性范围),而被广泛应用。 半乳糖苷酶报告基因半乳糖苷酶报告基因(galatosidase, gal) 大肠杆菌编码的大肠杆菌编码的galgal能水解乳糖为半乳糖。虽然能水解乳糖为半乳糖。虽然在很多细菌、植物和动物细胞中存在较高的本底在很多细菌、植物

11、和动物细胞中存在较高的本底, ,而而限制了它的使用限制了它的使用, ,但常用做转染的参照体系。通过使但常用做转染的参照体系。通过使用特定的方法用特定的方法, ,还能够区别内外源性的还能够区别内外源性的 gal( gal(改变缓改变缓冲液的等冲液的等) ) 检测方法检测方法: :比色法、荧光法、化学发光法、比色法、荧光法、化学发光法、FACSFACS等。等。 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶( glucuronidase, GUS)报报告基因告基因 是大肠杆菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。 主要用于缺乏该酶的病毒性植物病原体、植物、酵母、及真菌等的研究中,在医学研究中相对应用较少。 绿色荧光蛋白绿色

12、荧光蛋白(GFP(GFP）报告基因）报告基因 该基因来源于西北太平洋海域的水母。该蛋白在紫外光下发射荧光,而可以被多种方法检测。该报告基因检测不需要底物。 绿荧光蛋白在加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶均不能使它灭活。可用荧光显微镜或荧光激活的FACS进行检测, 能在活细胞条件下观测,而且能进行细胞内的定位分析。能在转基因小鼠中以无害的形式整合于小鼠的DNA中。 分泌型碱性磷酸酶分泌型碱性磷酸酶(Secreted alkaline (Secreted alkaline phosphatase, SEAP)phosphatase, SEAP)报告基因报告基因 该酶为人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)的突变体,也有从北大西洋海域中的耐热细菌中