细胞免疫荧光步骤

1、1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4PFA里面室温下固定 30 分钟， PBS洗两次， % TX-100 室温下作用 12 分钟使 细胞膜通透。3. 接下来进行荧光标记， 需要在一个大的容器 （面积大， 扁平状的， 比如大的培养皿） 里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。4. 剪一片合适大小的 parafilm ，在上面滴上稀释在 1 BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS里洗三次。5. 接下来二抗孵育步骤同上。6. 最后，在

2、载玻片加上 mounting medium（大约每个玻璃片加 10ul ），把玻璃片放上去（细 胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。8. 双标的话， 可以把两个一抗一起加或者分别标记两次 （可以都试一下看看那种方法合适） 。 如果一个抗体需要二抗， 一个是直接荧光标记的， 可以把荧光标记的那个和另外一个的二 抗一起加。方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于 rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是 不同荧光信号标记 的 ，我 用的是 donkey an

3、ti-rabbit-FITC （绿）和 donkey anti-rat-Tex-Red （红）。2. 我的做法是两种一抗同时孵育， 然后两种二抗同时孵育。 抗体浓度、 孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗 4 度孵育过 夜比较好，背景比较清晰。3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的 IgG ，荧光标记物对 照是 PBS+荧光标记物。4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常 donkey 血清。5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。方法三：1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在 24well/12well/96well 中直接 染色2. 细胞

4、爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无 菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。4. 其实小的 well 的话，可以直接拿来染色，没问题的。5. 固定：用 PBS 洗去培养液，用固定液(如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。 。)固定细胞。6. 内源性过氧化物酶处理， 3%过氧化氢处理细胞(选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做) 。7. 通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做) ，一般选用 Triton-X100 来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是%，处理时间为 1-30

5、分钟，级个别需要到1-2 小时。8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度 in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如 santa cruze,Abcam,sigma 。选取具体的抗体， 但是一抗的稀释浓度也是要摸索， 抗体稀释液可以购买抗体公司现成的， 对于新手还是挺好的。时间一般是 4 度过夜或者 37 度 1 小时。一抗最好还是选用外国 抗体公司的抗体。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也 行，就是选在哪个动物体内

6、做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是 需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是 37 度半小时。12. 底物显色(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能 需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)13. 洗去二抗，染核14. DAPI 或者 Hoechst 染核15. 洗去染核液，加 PBS，上镜观察。方法四：(1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的 培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片， PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生 长细胞， 用 PBS离心洗涤 (10

7、00rpm ，5min)2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备 细胞涂片。(2) 固定。 根据需要选择适当的固定剂固定细胞。 固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的 PBS中 4保存 3 个月。 PBS洗涤 3×5 min 。(3) 通透。使用交联剂 ( 如多聚甲醛 ) 固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行 通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透 的时间一般在 5-15min 。通透后用 PBS洗涤 3×5 min 。(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为 30min。（5）一抗结合。室温孵育 1h或者 4过

8、夜。 PBST漂洗 3 次，每次冲洗 5min。（6）二抗结合。 间接免疫荧光需要使用二抗。 室温避光孵育 1h。PBST漂洗 3 次，每次冲洗 5min 后，再用蒸馏水漂洗一次。（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。方法五：1 漂洗血清蛋白， 37 度 PBS 2 小时.2 -20 度甲醇固定 20 分钟后，自然、干燥 10 分钟3 PBS洗净： 3min 34 1%Triton ： 25min-30min. 配成 50ultriton+5mlpBS5 PBS洗净： 2 5min6 羊血清封闭： 37 度， 20分钟7一抗， 4度过夜，一般要大于 18小时或者 37度1-2

9、 小时8 4 度 PBS 洗净， min 5 次9 二抗 37 度小于一小时10 37 度 PBS洗净， 3 3min11 凉干封片（封闭液）细胞免疫荧光步骤：1. 细胞爬片； 首先是玻片的处理， 普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块， 先用洗 衣粉洗干净， 用水冲静烤干， 然后泡酸过夜， 捞酸后流水洗净， 烤干， 置于器皿中高压灭菌， 然后再烤箱中大约 8 小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或 24 孔板中都可， 我选择在培养皿中爬。 一为节约经费 （培养皿可以重复利用） 二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，

10、使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量），将玻片小心放入取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触）37 度 5 CO2摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24 小时或更长时间适时取出爬片。爬片置于 37 度 PBS中洗三次，每次 3到 5秒钟，然后在 4多聚甲醛中固定 15 分钟，然后 再用 37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注 意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干， 然后用中性树胶粘在载玻片上。 注意一定要等中性树

11、胶彻底 干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可 以放在 20 保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。%多聚甲醛固定 10min（ 固定细胞器用预冷的 70%甲醇+30%丙酮 ）；漂洗 5min；Triton 穿孔 15min（ 丙酮固定法不用透化处理 ）；漂洗 2 次，每次 5min；%BSA封闭 30min ；7. 加入 1%BSA稀释的一抗，于 37杂交 2h；漂洗 2 次，每次 5min；9. 加入 1%BSA稀释的二抗，于 37杂交 1h；漂洗 2 次，每次 5min；ml DAPI 染色 2min ；12. 抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂 : % DABCO (w/v) 50mM Tris 90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定 10min（ 固定细胞器用预冷的 70%甲醇 +30%丙酮 ）PBS漂洗 5min% Triton 穿孔 15min（ 丙酮固定法不用透化处理 ）PBS漂洗 2 次，每次 5min1%BSA封闭 30min加