细胞克隆形成实验

1、细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖 6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。 每个克隆含有 50 以上的细胞，大小在之间。集落形成率表示细胞的独立生存能 力。各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。 通过一定的实验方法 可以对细胞的克隆形成能力进行检测。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都 能增殖和形成克隆。 而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。 克隆形成 率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 由于细胞生物学性状不同， 细 胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱， 传代细胞系强； 二倍体细胞克隆形成率弱，

2、转 化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞， 分别用 %胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 并把细 胞悬浮在 10%胎牛血清的 DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿 50、100、200 个细胞的梯 度密度分别接种含 10mL3 7预温培养液的皿中， 并轻轻转动， 使细胞分散均匀。 置 37 5

3、% CO2 及饱和湿度的细胞培养箱中培养 2 3 周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS小心浸洗 2 次。加 4%多聚甲醛固定细胞 5mL固定 15 分钟。然后去固定液， 加适量 GIMSA应用染色液染 1030 分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干 燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微 镜（低倍镜）计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数 / 接种细胞数）× 100%平板克隆形成试验方法简单， 适用于贴壁生长的细胞。 适宜底物为玻璃的、 塑料 瓶皿。试验成功的关键是

4、细胞悬液的制备和接种密度。 细胞一定要分散得好， 不 能有细胞团，接种密度不能过大。平板克隆形成试验方法简单， 适用于贴壁生长的细胞。 适宜底物为玻璃的、 塑料 瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。 细胞一定要分散得好， 不 能有细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：(1) 取对数生长期细胞， 用%胰蛋白酶消化并轻轻吹打， 使之成为单细胞， 作活细 胞计数，用含 20%胎牛血清的 DMEM培养液调整细胞密度至 1×106 细胞/L 。然后 根据实验要求作梯度倍数稀释。(2) 用蒸馏水分别制备出 %和%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在 40中

5、不会凝固。(3) 按1:1比例使%的琼脂糖和 2×DMEM培养基(含有2×抗生素和 20%的小牛血清 ) 混合后，取 3mL混合液注入直径 6cm平皿中 (10cm平皿加 710mL)，冷却凝固， 可作底层琼脂置 CO2温箱中备用。(4) 按 1:1 比例让 %的琼脂糖和 2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后， 再向管中 加入的细胞悬液，充分混匀，注入铺有 %琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。 待上层琼脂凝固后，置入 37 5%CO2温箱中培养 1014 天。(5) 把平皿放置在倒置显微镜下， 观察细胞克隆数。 计算形成率。 软琼脂培养法 常用检测肿瘤细胞和转化

6、细胞系。 试验中琼脂与细胞相混时， 琼脂温度不宜超过 40。接种细胞的密度每平方厘米不超过 35 个，一般 6cm的平皿接种 1000 个细 胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。软琼脂集落形成率实验 (软琼脂克隆 )将低熔点琼脂糖与 2×细胞培养基以 1:1 的体积比混合制备的底层琼脂， 6 孔板中每个孔 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计 数，并调细胞浓度为 10000 个/ml ，将低熔点琼脂糖与 2×细胞培养基以 1:1 的 体积比混合， 制备的上层琼脂， 每孔加 1ml 上层琼脂和 100ul 单细胞悬液（约 1000

7、cell/well） ，混匀，室温凝固。置于 37， 5CO2 的细胞培养箱中培养 2 3 周，计数含 50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率， SpotII 采集图 像。注意事项1. 接种时细胞密度适度，不可过高。2. 软琼脂与细胞混合时温度不能超过 40，否则将会烫伤 / 死细胞；3. 琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。因此 高压灭菌后应进行分装；4. 细胞在进行克隆形成实验时要求有 95%以上的分散度， 否则结果的准确度会受 到很大影响；5. 细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系 / 株克 隆形成率可达到 10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅 为%-5%，甚至无法形成单个克隆。因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养 基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆