半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

1、半定量RT-PCR勺实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA勺抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30c孵育2至IJ3分钟。4c下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNAb部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%RNAM淀将水相上层转移到一干净无RNA喝的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA混匀后15到30c孵育10分钟后，于4c下12000rpm离心10分钟。此时

2、离心前不可见的RNAC淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA青洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%醇用DEPCHO配制）,清洗RNAC淀。混匀后，4c下7000rpm离心5分钟。RNA燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNM淀在室温空气中干燥5-10分钟。溶解RNA溶解RNA寸，先加入无RNAW勺水40屋用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA容液保存于-80C待用。2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNAS液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RN

3、A容液浓度和纯度。浓度测定A260下读值为1表示40NgRNA/ml样品RNAft度（Ng/ml）计算公式为：A260X稀释倍数X4011g/mlo具体计算如下：RNA容于40履DEPCK中，取5ul,1:100稀释至495仙1的TE中，测得A260=RNA浓度=X100X40Ng/ml=840g/ml或仙g/膜取5ul用来测量以后，剩余样品RNA*35屋，剩余RNA总量为：351Xg/1=纯度检测RNA容液的A260/A280的比值即为RNA屯度，比值范围到。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C,10ml的10XMOPSI泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液M

4、）。10XMOP蜕泳缓冲液浓度?成分?MOP，SpH?乙酸钠?EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入251溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1XMOPS1泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA羊品取3gRNA加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10仙g/ml。加热至70c孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5-6V/cm电压下2h,电泳至澳酚兰指示剂进胶至少2-3cm,紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA勺带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA勺物种类型)，上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍

5、。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA(tRNA和5s核糖体RNA组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EBft色物质，可能是由mRN和其它异型RNAA成。RNAJ备过程中如果出现DNA亏染，将会在28S核糖体RNA的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA勺降解表现为核糖体RNA的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDN始成反应体系序号?反应物?剂量1?逆转录buffer?2a12?上游弓I物？屋3?下游引物？屋4?dNTP?15?逆转录酶MMLV?16?DEP(C?5仙17?RNAf版？?2仙18?总体积？10仙1轻弹管底将溶液混合，6000

6、rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV1前先70c干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶膜，37c水浴60分钟。取出后立即95c干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA容液，保存于-80C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(B-actin)实时定量PCRB-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3屋按10倍稀释(加水27屋并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号?反应物?剂量1?SYBRGreen1染料？10屋2?阳性模板上游引物F?屋3?阳性模板

7、下游引物R?屋4?dNTP?15?Taq酶?116?阳性模板DNA?517?ddH2O?以18?总体积？?50仙1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号?反应物?剂量1?SYBRGreen1染料？10仙12?内参照上游引物F?屋3?内参照下游引物R?屋4?dNTP?15?Taq酶?116?待测样品cDNA?517?ddHO?N18?总体积?50仙1轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93c2分钟，然后931分钟，552分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA真板针对每一需要测量的基因，选择一

8、确定表达该基因的cDNA真板进行PC阪应。反应体系：序号?反应物?剂量1?10XPCR缓冲液？ul2?MgCl2溶液?ul3?上游引物F?ul4?下游引物R?ul5?dNTP昆合液?3ul6?Taq聚合酶？?1ul7?cDNA?1ul8?加水至总体积为?25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR1环（94C1分钟；55C1分钟；72c1分钟）；72oC延伸5分钟。PCRT物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，澳化乙锭染色，检测PCRT物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1X1010,依次稀释至

9、109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6待测样品的待测基因实时定量PCR所有cDNA羊品分别配置实时定量PCR反应体系。体系配置如下：序号?反应物?剂量1?SYBRGreen1染料?10ul2?上游引物?1ul3?下游引物?1ul4?dNTP?1ul5?Taq聚合酶？?2ul6?待测样品cDNA?5ul7?ddH2O?30ul8?总体积?50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR5应溶7置于RealtimePCR仪上进行PCRT增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按931分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7实

10、时定量PCRfg用引物列表引物设计软件：PrimerPremier，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行RealtimePCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCRT物是否为单一特异性扩增条带。RT-PCR以RNM模板的cDN*成同PCR吉合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDN库克隆cDNART-PCRt匕其他包括Northern印迹、RNase呆护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNAb析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR勺模板可以为总RNMpoly(A)+选择性RNA逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP起始。RT-PCR