《ELISPOT方法》ppt课件

1、一、ELISPOT检测细胞因子实验技术vELISPOT检测方法特点 经过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况 在分泌细胞原处捕获该细胞分泌的细胞因子 斑点的生成属于一种显色反响：SPOT=细胞印迹 斑点可耐久保管并进展计数分析v可在单细胞程度检测淋巴细胞对特异性抗原的反响才干v计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的比例v有效、快速、灵敏度高v 运用高吸附性的公用ELISPOT培育板v 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰v 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍v易操作v样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进展快速、客观的分析106抗

2、原呈递细胞APC中混入特定数量的IFN-+的T淋巴细胞 ，经以下方法检测： ELISPOT 细胞内细胞因子染色FACS ELISAX X坐标：坐标： 106 APC106 APC中实践中实践IFN-+TIFN-+T细胞数量细胞数量Y Y坐标：坐标： 各检测方法的检测结果各检测方法的检测结果 ELISPOT/FACS/ELISA ELISPOT/FACS/ELISA 检测准确度比较检测准确度比较Coating Ab 包被培育孔并经BSA阻断根据实验设计参与淋巴细胞及含或不含刺激因子的培育液孵育v 基基 本本 原原 理理活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与Coating Ab结合洗除细胞，依次参与生物素

3、标志的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进展反响参与酶底物显色构成斑点SPOT B细胞杂交瘤的挑选 化合物和药物免疫学反响的检测 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 靶向疫苗的质控 本身免疫疾病的诊断和预后分析 本身免疫疾病免疫治疗的监控 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 器官移植中排斥反响的预测 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 结核病的诊断v ELISPOT方法主要用途Stable Patients77%23%High Risk Patients73%27%IFN-g Spots 60P=0.0213Distribution of MHC mismatched renal transplant

4、patients per frequency of IFN-gamma producing allopetide reactive T Cells Najafian N, Salama A, Illigens BW, et.al BRIGHAM AND WOMENS HOSPITALCHILDRENS HOSPITAL HARVARD MEDICAL SCHOOL BOSTON, MAMinor-mismatched AllograftMajor-mismatched Allograft0250500750SpotsIFN- gamma producing Cells in minor vs.

5、 major-mismatched WT Allograft Recipients on Day 14PubMed搜索关键词immunospot或ELISPOT或ELISA-Spot所得历年文献数目v猴ELISPOT细胞因子检测流程表示图Coating Ab包被培育板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔参与1%BSA阻断按实验设计参与含或不含刺激剂的培育液及一定数目细胞孵育5-24小时40C过夜370C孵育1小时取外周血单核细胞或脾淋巴细胞根据实验要求，培育液中参与所需刺激物，预先将所检测细胞孵育24-42小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞或者去除细胞，参与冰冻去离子

6、水200ul/孔，培育板置冰上10分钟 参与生物素标志的detector Ab参与酶标抗生物素抗体(GABA)40C暗处混合显色剂I和II, 参与显色剂I/II,暗处室温孵育20-30分钟 PBST洗板10次370C孵育1小时后，PBST洗板5次370C孵育1小时后，PBST洗板5次显微镜下察看至斑点构成，去离子水清洗培育板 室温枯燥后在倒置显微镜下察看结果非无菌v 技 术 要 点 预孵育的淋巴细胞假设有坏死/凋亡培育液过黄会影响斑点的构成 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰 入ELISPOT培育孔的细胞须为单细胞悬液 细胞孵育过程应保证ELISPOT培育板静置，CO2培育箱应保证稳定，防止

7、震荡 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保管过程防止细菌的污染以保证其成效 显色剂I和II应避光保管，不运用时切勿混合ELISPOT实验技术广泛运用的主要缘由之一就在于酶联斑点自动图象分析仪ELISPOT READER及相应图象分析软件的出现Bioreader 3000TM PRO Bioreader 3000TM PRO 酶联斑点自动图象分析仪酶联斑点自动图象分析仪适用于分析：适用于分析：酶联斑点酶联斑点(Elispot)(Elispot)克隆构成克隆构成CFUCFU病毒斑病毒斑Viral PlaqueViral Plaquev 原 理 示 意 图 加强培育板上斑点成像对比度 有效抑制因板孔侧壁反光呵斥的“幻影景象，准确识别微孔边沿处斑点。v专利3D双照明系统v培育孔边沿识别功能 选定培育板参数设定Border Offset数值Border Offset数值普通为3-10mm3 v漂洗功能WASH OUT ELISPOT原始图象显微镜下Bioreader优化图象Bioreader结果分析图象可进展背景的优化和补偿部分背景校正度、wash out背景补偿程度等参数可由用户根据需求设定斑点光密度(Optical Density)分析及交融斑点的自动分别v4种形状测定参数用户可根据需求设定参数上下限，保证检测的准确度v完善的实验结