四君子护康颗粒剂的主要药效学研究

1、主要药效学研究 四君子汤可以促进MTL的分泌,改善和促进胃肠动力，治疗脾胃气虚证。对面色萎白，语声低微，气短乏力，食少便溏，舌淡苔白，脉虚弱等均有疗效。（常用于慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡等属脾气虚者。） 研究资料 中医认为脾的主要功能是“脾主运化”,脾失健运则机体的消化、吸收等功能减退,说明中医学“脾”的主要生理功能及病理表现与现代医学消化系统关系密切。观察消化道各部分消化功能及影响因素是研究中医“脾主运化”理论的重要组成部分。胃肠激素在调节胃肠道的消化吸收等活动中起着非常重要的作用,胆囊收缩素(cholecysto-kinin, CCK)、胃动素(motilin, MTL)与动物的胃肠运动功

2、能密切相关。但目前的相关文献多局限于胃肠运动或胃肠激素的单方面研究,对胃肠道消化功能的多层面研究较少。因此,笔者等以利血平建立大鼠脾虚模型,检测胃肌电活动和胃肠运动的变化,以及胃和小肠内CCK和MTL蛋白含量的变化,探讨健脾补虚经典方剂四君子汤对脾虚大鼠消化运动功能的影响。1材料与方法1.1药品及主要试剂 仪器健康雄性SD大鼠36只(体重290±20 g),北京维通利华实验动物技术有限公司提供。利血平注射液(1 mg/mL,批号090409)购自广东邦民制药厂有限公司;四君子汤颗粒(批号080301)购自湖北武当生物制药有限公司;羧甲基纤维素钠购自sigma公司;速眠新购自军需大学兽

3、医研究所(批号20080310);蛋白提取试剂盒、蛋白BCA法测定试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司; CCK、MTLELISA测定试剂盒购自R&B公司;生物医学信号采集处理系统(Pclab-UE, China);超低温冰箱(SANYO, Japan); 680型酶标仪(BIO-RAD, USA)。1.2动物分组和模型处理 供试大鼠适应性饲养3 d(每天给予充足的饲料和饮水),随机分为3组:对照组、脾虚组和治疗组。脾虚组、治疗组腹腔注射利血平0. 5 mg/kg·d1,对照组腹腔注射相应剂量的生理盐水;同时,四君子汤治疗组灌服四君子汤8 mL/kg·d(剂量根据人和

4、大鼠体表面积换算,约合生药0. 233 g/mL),对照组和脾虚组灌服相应剂量的生理盐水,连续7 d。每天观测大鼠临床表现,于试验0、8、15 d测定各组大鼠体重变化。1.3胃排空率的测定 取羧甲基纤维素钠10 g,溶于250 mL蒸馏水中,加入奶粉16 g,糖8 g,淀粉8 g,活性炭3 g,搅拌均匀最后制成约300 mL营养性半固体糊,冰箱冷藏,用前2 h取出,恢复至室温。试验14 d,禁食24 h,每组随机取4只大鼠按10mL/kg营养性半固体糊灌胃,灌胃前称定营养性半固体糊重量。30 min后断颈法处死大鼠,剖腹取全部胃肠,自幽门切迹处取胃,拭干称重,沿胃大弯剪开胃体,洗去胃内容物后拭

5、干,称净重。计算胃排空率(% ) =1-(胃全重-胃净重)÷营养性半固体糊重量×100。1.4肠推进功能测定 自盲肠处取上述大鼠的全肠,不加牵拉铺平于白纸上,分别量取自幽门括约肌至营养性半固体糊最前端(营养性半固体糊移动距离)及至盲肠(幽-盲全长)的距离。计算肠推进比(% ) = (营养性半固体糊移动距离÷幽-盲全长)×100。1.5胃窦肌电测定 试验15 d,从每组剩余大鼠中随机取4只,速眠新按1 mL/kg肌肉注射麻醉后,仰卧保定,打开腹腔,将一对正负电极(间距1. 5 mm)置于胃窦浆膜下,接地电极置于左下肢骨骼肌内。在麻醉状态下记录胃肌电变化,每

6、次记录30 min,计算机采集胃肌电波形及频率的变化。1.6胃肠道组织中CCK和MTL蛋白含量 变化试验15 d,将每组剩余4只大鼠断颈处死,浸入75%酒精3-5次,取出置于无菌容器中。在无菌条件下取出胃和小肠,立即用生理盐水冲洗干净,分别取胃窦(从胃幽门至胃小旁角切迹处取胃窦腹侧壁全层组织)、十二指肠(距离幽门口5 cm处)、空肠(距离幽门口20 cm)、回肠(接近盲肠15 cm处),迅速置于液氮中, -80保存。提取试验各组大鼠胃窦、十二指肠、空肠和回肠中总蛋白,用BCA法测定总蛋白含量, ELISA检测CCK和MTL含量,严格按试剂盒说明书操作。1.7统计处理用DPS7. 05统计软件,

7、显著性分析采用方差分析,结果以平均值±标准差表示。2结果2.1临床症状脾虚组在注射利血平后第3天开始出现明显腹泻症状,第5天开始出现肛周污秽,消瘦,被毛枯槁无光泽,精神萎靡、扎堆、拱背等症状。治疗组粪便基本成形,体重上升,无明显萎靡、扎堆、拱背症状,与脾虚组比较,症状明显好转。2.2四君子汤对胃排空和肠推进影响与对照组比较,脾虚组胃排空率下降,肠推进率升高,差异极显著(P<0. 01)。治疗组胃排空率升高,肠推进率降低,与对照组无明显差异,但与脾虚组比较差异极显著(P<0. 01)。见表1。2.3 胃窦肌电变化对采集的胃电信号记录曲线进行分析发现,与对照组比较,脾虚组胃电

8、振幅和频率均显著降低(P<0. 05);与脾虚组比较,治疗组胃电振幅和频率显著升高(P<0. 05),但治疗组胃电振幅未能恢复到对照组水平。见表2、图1。2.4四君子汤对脾虚大鼠胃肠道CCK和MTL蛋白表达的影响 脾虚组CCK含量在胃窦内升高,在十二指肠和空肠内降低,与对照组比较差异显著(P<0.05);与脾虚组比较,治疗组CCK蛋白含量在胃窦内降低,在十二指肠和空肠内回升,除空肠内CCK蛋白含量与对照组比较差异显著(P<0. 05)外,其他均恢复至对照组水平。MTL蛋白含量仅在空肠内存在生物统计学差异,脾虚组MTL蛋白含量降低,与对照组和治疗组比较差异极显著(P<

9、;0. 01);治疗组和对照组无统计学差异。见图2。3讨论 利血平是一种主要作用于去甲肾上腺素能神经末梢的抗高血压药,能够耗竭肾上腺素能神经末梢内儿茶酚胺类递质,使动物出现交感神经功能低下、副交感神经功能亢进等症状,进而造成胃肠功能紊乱。适量的利血平可以在大鼠、家兔、豚鼠等多种实验动物中制造脾虚模型,其症状与人类最常见的以消化机能紊乱为主,并伴有神经内分泌功能紊乱的脾虚证型相似,可靠性和重现性都比较强,且简单易行,因此,利血平致动物脾虚模型是脾虚实验研究的常用模型。本试验中,脾虚组大鼠出现被毛枯槁、嗜卧、缩蜷、消瘦、饮食减少、粪便溏薄等症状,与前人报道结果相同,证明脾虚证模型构建成功。治疗组在

10、试验15 d时,无明显被毛枯槁、嗜卧、缩蜷、消瘦等症状,饮食基本正常,粪便基本成形,与脾虚组有明显差异。说明四君子汤能补脾助运,对脾虚证有治疗作用。中医理论中,脾的主要功能是“主运化”。脾失健运则机体的消化、吸收等功能减退,说明中医学“脾”的主要生理功能及病理表现与现代医学消化系统的关系密切。脾虚常伴有不同程度的胃肠动力障碍。前人研究发现,脾虚时胃肠运动节律紊乱,胃排空加快或延迟,肠推进加快但随病情加重而减弱。胃肠的运动形式都依赖于平滑肌电活动。胃肌电是由胃各不同部位的平滑肌所产生,胃不同部位平滑肌产生的胃肌电具有其本身固有且各不相同的频率。通常认为,静息电位的周期性变化形成了慢波的自发基本电

11、节律。慢波影响胃肠平滑肌的紧张性,但并不直接引起平滑肌的收缩。慢波触发动作电位的发生,在慢波上迭加的动作电位才能引起平滑肌收缩。近年来研究表明,胃肌电活动异常是胃动力障碍性疾病发病的主要原因之一。本试验结果显示,脾虚大鼠胃电振幅和频率降低,胃排空功能下降,肠蠕动加快,反映出脾虚时胃肌电紊乱,胃肠运动失调,临床表现出腹泻、粪便溏薄等症状,长期消化吸收功能低下会导致动物消瘦、精神萎靡等。经四君子汤治疗后,胃肌电振幅和频率上升,胃排空加快,肠推进减缓,证明四君子汤对脾虚大鼠表现出调节紊乱的胃肌电活动,从而兴奋运动功能低下的胃,抑制运动功能亢进的肠道,具有不同的调节作用。这主要是因为四君子汤可以调整紊

12、乱的消化道电节律和振幅10, 11,进而对胃肠运动进行调节。脾虚证是以胃肠道消化吸收功能降低为主要表现的神经体液调节紊乱、营养物质代谢低下的一种虚损性疾病。胃肠激素的作用涉及胃肠道分泌、运动、吸收、水电解质转运等几乎所有的胃肠功能调节。其中, CCK和MTL是胃肠道产生的主要以胃肠系为效应器官的调节肽。消化系统中的CCK由主要分布在十二指肠及空肠上端的细胞分泌,可以促进胃幽门括约肌收缩,抑制胃基础紧张度与自发性收缩,从而对胃排空起抑制作用。其在肠道运动中主要抑制近端十二指肠蠕动,促进远端十二指肠和空肠蠕动。研究发现脾虚组大鼠胃窦内CCK明显升高,而十二指肠和空肠内CCK显著下降,表现出小肠蠕动

13、加快,胃排空受抑制。治疗组大鼠消化道内的CCK水平与对照组比较无显著差异,说明四君子汤对脾虚大鼠消化道内胃肠激素的异常有治疗作用。MTL是一种重要的调节胃肠消化功能的胃肠激素,在机体内分布广泛,其生理作用主要是影响胃肠运动功能,在消化期间,血浆胃动素呈周期性释放,引起胃和小肠MMC相,诱发胃强烈收缩和小肠明显的分节运动,对胃肠道内容物起向后推移的作用。脾虚时,消化道内MTL含量异常可导致胃肌电节律紊乱,从而造成胃肠道机械运动功能紊乱,且消化道内MTL的含量与胃肌电节律呈正相关性。本试验中,脾虚组大鼠MTL水平明显下降,导致胃肌电振幅和频率下降,从而造成胃平滑肌松弛,张力及蠕动减弱,胃排空时间延

14、长四君子汤治疗后,MTL水平明显上升,说明四君子汤可以促进MTL的分泌,改善和促进胃肠动力,这是四君子汤通过健脾作用加强“运化水谷”的机理之一。此外，通过对脾虚大鼠血清消化酶和胃肠激素的影响，发现四君子汤对胃肠道胃窦局部GAS的含量具有调节作用,并间接降低了胃酸和胃蛋白酶过量分泌,对消化道起保护作用。1材料与方法1.1材料利血平注射液(1 mg/mL,批号090409)购自广东邦民制药厂有限公司;四君子汤颗粒(批号080301)购自湖北武当生物制药有限公司;血清淀粉酶、血清脂肪酶测定试剂盒购自南京建成生物研究所;反转录试剂盒购自BIO-RAD公司。1.2动物分组健康、成年雄性SD大鼠24只,体

15、重(290±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机分成3组:对照组,脾虚组,治疗组。适应性喂养3 d。试验期间自由饮水,饲喂固体饲料。1.3试验处理脾虚组、治疗组腹腔注射利血平0.5 mg/kg·d3,对照组腹腔注射相应剂量的生理盐水,连续7 d。从8 d开始,治疗组灌服四君子汤8 mL/kg·d(剂量根据人和大鼠体表面积换算,约合生药0.233 g/mL),对照组和脾虚组灌服相应剂量的生理盐水,连续7 d。每天观测记录大鼠临床表现,于试验0 d、8 d、15 d测定各组大鼠体重变化。试验15 d,眼球采血。颈椎脱臼处死大鼠。将处死的大鼠浸入75%酒

16、精35次,取出置于无菌容器中。在无菌条件下,取出胃和小肠,立即用生理盐水冲洗干净,分别从胃窦(从胃幽门至胃小旁角切迹处,取胃窦腹侧壁全层组织)、十二指肠(距离幽门口5 cm处)、空肠(距离幽门口20 cm处)、回肠(接近盲肠15 cm处),迅速置于液氮中,-80保存。1.4血清淀粉酶和脂肪酶的测定将眼球采血的血样,37放置60 min,4下3 000 r/min离心10 min,取上清分装,-80保存,待测。血清在1周内,按试剂盒说明书操作测定淀粉酶和脂肪酶活性。1.5试验大鼠胃肠组织中VIP和GAS mRNA表达差异参照GenBank大鼠基因序列采用Primer5.0软件设计了3对引物,由北

17、京奥科生物技术有限责任公司合成,引物序列及参数见表1。以-ac-tin为内参,计算样本和-actin的比值。1.6 统计处理用DPS 7.05统计软件,显著性分析采用方差分析,结果以平均值±标准差表示。2结果与分析2.1 临床表现大鼠在注射利血平后3 d开始出现明显的拉稀症状, 5 d开始出现肛周污秽、消瘦、活动频度下降、扎堆、拱背、眯眼、被毛枯槁无光泽等症状。上述症状与前人报道的结果相同,说明脾虚证模型构建成功。四君子汤治疗后,上述症状均有明显好转。试验0 d,各组体重无明显差异;试验8 d,脾虚组和治疗组体重下降,显著低于对照组(P<0.05),治疗组与脾虚组无明显差异;试

18、验15 d,脾虚组体重显著低于对照组(P<0.05),与治疗组差异不明显,治疗组体重显著低于对照组(P<0.05)(见表2)。2.2血清中消化酶活力变化脾虚组血清淀粉酶极显著下降,低于对照组(P<0.01);治疗组极显著(P<0.01)高于脾虚组和低于对照组。脾虚组血清脂肪酶显著上升,高于对照组(P<0.05);治疗组显著(P<0.05)低于脾虚组而高于对照组(见表3)。血清淀粉酶活力(U/L) 1 241.2±±±8.0B血清脂肪酶活力(U/L) 33.5±±±28.7b2.3四君子汤对脾虚大鼠胃

19、肠道VIP和GASmRNA表达量的影响与对照组比,脾虚组VIPmRNA表达量在十二指肠显著下降(P<0.05),在空肠显著下降(P<0.05);GAS mRNA表达量在胃和回肠内升高,在十二指肠和空肠下降,与对照组比差异显著(P<0.05)。与脾虚组比,治疗组VIPmRNA表达量在十二指肠明显上升(P<0.05);GAS mRNA表达量在十二指肠和空肠明显升高(P<0.05),在回肠内显著降低(P<0.05)(见图1)。3讨论 利血平致大鼠脾虚是中国传统医学中脾虚证模型的一种经典造模方法。利血平主要通过降低交感神经的功能,使副交感神经功能相对或绝对亢进。从而

20、出现体重减轻、腹泻、耐寒力差等与临床脾虚泄泻相似的症状5。通过临床指标的观测,我们可以发现脾虚组出现眯眼、被毛枯槁无光泽、扎堆、拱背、拉稀、消瘦等,表明大鼠脾虚模型已经成功建立。经四君子汤治疗后,无明显皮毛枯槁、嗜卧、缩蜷现象,粪便基本成形,采食和饮水恢复正常,体重有所恢复。说明四君子汤具有补脾助运的功效,对脾虚证有良好的治疗作用。“脾主运化”与消化系统关系密切,消化系统功能与形态的异常是脾虚最基本的病理变化。其中,胰腺外分泌功能的异常也是脾虚证发生的病理机制之一。血清淀粉酶和血清脂肪酶主要来自胰腺外分泌,吸收入血形成。当胰腺发生病变时,在胰腺内合成的淀粉酶和脂肪酶等,因胰腺腺泡大量破坏,胰管

21、阻塞,阻碍了酶进入十二指肠,从而返流入血,使其各自的血浓度骤然升高6。但血清淀粉酶活性在急性胰腺炎发病后48 h内急剧升高,达到峰值后逐渐下降。本试验结果中脾虚组淀粉酶活性降低,脂肪酶活性升高,与对照组比差异明显,提示脾虚时胰腺的结构和功能发生了非急性炎性病变。前人研究证明,胰腺的炎性病变产生的炎性介质、内毒素、氧自由基等能够引起胃肠神经功能紊乱,致肠壁肌肉活动紊乱,可导致胃肠运动障碍,影响胃肠道平滑肌的收缩7。因此,脾虚证可造成试验动物消化功能紊乱。治疗组与脾虚组比,淀粉酶活性升高,脂肪酶活性降低。说明四君子汤对脾虚导致的血清消化酶活性异常及胰腺损伤有治疗作用,可以修复受破坏的胰腺腺泡,疏通

22、阻塞的胰管,促进胃肠道的消化功能。在关于胃肠消化功能障碍的发病机理研究过程中,研究者发现胃肠激素是调节胃肠消化吸收功能的一个重要因素。胃肠道局部组织中胃肠激素含量的变化可以影响胃肠消化吸收机能状况8。VIP和GAS是影响胃肠消化功能的重要胃肠激素VIP利血平致大鼠脾虚是中国传统医学中脾虚证模型的一种经典造模方法。利血平主要通过降低交感神经的功能,使副交感神经功能相对或绝对亢进。从而出现体重减轻、腹泻、耐寒力差等与临床脾虚泄泻相似的症状。通过临床指标的观测,我们可以发现脾虚组出现眯眼、被毛枯槁无光泽、扎堆、拱背、拉稀、消瘦等,表明大鼠脾虚模型已经成功建立。经四君子汤治疗后,无明显皮毛枯槁、嗜卧、

23、缩蜷现象,粪便基本成形,采食和饮水恢复正常,体重有所恢复。说明四君子汤具有补脾助运的功效,对脾虚证有良好的治疗作用。“脾主运化”与消化系统关系密切,消化系统功能与形态的异常是脾虚最基本的病理变化。其中,胰腺外分泌功能的异常也是脾虚证发生的病理机制之一。血清淀粉酶和血清脂肪酶主要来自胰腺外分泌,吸收入血形成。当胰腺发生病变时,在胰腺内合成的淀粉酶和脂肪酶等,因胰腺腺泡大量破坏,胰管阻塞,阻碍了酶进入十二指肠,从而返流入血,使其各自的血浓度骤然升高。但血清淀粉酶活性在急性胰腺炎发病后48 h内急剧升高,达到峰值后逐渐下降。本试验结果中脾虚组淀粉酶活性降低,脂肪酶活性升高,与对照组比差异明显,提示脾

24、虚时胰腺的结构和功能发生了非急性炎性病变。前人研究证明,胰腺的炎性病变产生的炎性介质、内毒素、氧自由基等能够引起胃肠神经功能紊乱,致肠壁肌肉活动紊乱,可导致胃肠运动障碍,影响胃肠道平滑肌的收缩。因此,脾虚证可造成试验动物消化功能紊乱。治疗组与脾虚组比,淀粉酶活性升高,脂肪酶活性降低。说明四君子汤对脾虚导致的血清消化酶活性异常及胰腺损伤有治疗作用,可以修复受破坏的胰腺腺泡,疏通阻塞的胰管,促进胃肠道的消化功能。在关于胃肠消化功能障碍的发病机理研究过程中,研究者发现胃肠激素是调节胃肠消化吸收功能的一个重要因素。胃肠道局部组织中胃肠激素含量的变化可以影响胃肠消化吸收机能状况。VIP和GAS是影响胃肠

25、消化功能的重要胃肠激素。VIP是非肾上腺非胆碱能(NANC)抑制性神经递质,在整个胃肠道均有分布。VIP可引起整体胃肠道环形平滑肌的松弛。同时,脾虚导致的胰腺炎性病变可造成VIP的分泌异常。由试验研究可知,脾虚组与对照组比,胃肠道内VIP含量降低;治疗组虽未完全恢复到对照组水平,但相比脾虚组已经有所好转。VIP含量减低,则胃肠道平滑肌松弛功能下降,肠道蠕动加快,导致水和营养物质消化吸收不完全即排出,造成便溏。四君子汤可以通过对胰腺的修复和调节局部胃肠道内VIP含量,进而调节胃肠道的消化吸收功能。GAS由G细胞产生,大多数GAS在胃窦区域分泌,其他部位含量较少。GAS几乎对整个胃肠道都有作用,可

26、强烈刺激胃壁细胞分泌胃酸;促进胃蛋白酶、胰液、胰泌素和胆汁中水、盐的分泌;能增加黏膜血流量,促进黏膜细胞分裂分化,使黏膜增厚,促进胃肠道黏膜生长。本试验中,脾虚组胃窦内GAS升高,我们可推测,因胃酸大量分泌和黏膜血流量的增加,胃壁受胃酸侵蚀受损伤,黏膜充血,胃部消化功能下降;十二指肠和空肠内的GAS含量下降,导致黏膜细胞增殖能力下降,肠壁变薄,肠黏膜绒毛变短,消化吸收能力降低。治疗组胃窦内GAS含量比脾虚组少,说明四君子汤对胃肠道胃窦局部GAS的含量具有调节作用,并间接降低了胃酸和胃蛋白酶过量分泌,对消化道起保护作用。【参考文献】:1赵宁,贾红伟,张皖东,等.理中丸对利血平所致脾虚大鼠血清中细胞因子的影响J.中国中医基础医学杂志, 2007, 13(8): 588-589.2李仪奎.中药药理实验方法学M.上海:上海科学技术出版社, 2006: 162-163.3 Gafvelin G, CarlquistM