甘草中甘草苷含量测定

1、长沙医学院毕业设计(论文)课 题 名 称 HPLC法测定参苓散中甘草苷的含量 学 生 姓 名 姜声正 学 号 系、年级专业 07级本科药学 指 导 教 师 肖海英 职 称 讲师 2011年 6 月 9 日诚信声明本文郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究所取得的成果，成果不存在知识产权争议。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。作者签名：日 期： 年 月 日高效液相色谱法测定参苓散中甘草苷含量姜声正长沙医学院药学系07

2、级药学本科摘要目的：用HPLC法测定参苓散中甘草苷的含量。 方法：分别采用Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)和Agilent TC-C18( 250mm ×4.6 mm×5µm），乙腈0.5冰醋酸（1090）为流动相，流速为1.0 ml/min，检测波长为276nm，柱温为35，结果：平均回收率为101.6%，RSD为1.9%， R=0.9998。 结论：本方法可作为参苓散中甘草苷含量质量控制的一种有效方法。关键词：参苓散；甘草苷；高效液相色谱法；含量测定Determination of Liquiritin in Sh

3、enling Powder by HPLCJiang ShengzhengGrade 2007，Parmacy Department of Changsha Medical CollegeAbstract Objective: Determination of liquiritin in Shenling powder by High Performance Liquid Chromatography. Methods: Based on using respectively Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)， Agilent TC-C18( 25

4、0mm ×4.6 mm×5m），acetonitrile0.5 and glacial acetic acid（10：90）for moving phase at the flow velocity of 1.0 ml/min， the method is to determine if the wavelength is 276 nm and that column temperature is 35. Results: Average recovery rate ：101.6% RSD: 1.9% R=0.9998。Conclusion: This method is

5、an effective way to qualitatively control the content of liquiritin in Shenling powderKey words: Shenling powder ；Liquiritin；HPLC；Assaying目 录摘要IAbstract前言11 实验材料21.1仪器21.2 试药22 方法与结果32.1 色谱条件32.2 对照品溶液的制备32.3 测定波长的确定32.4流动相的选择42.5 线性关系考察62.6 检测限62.7 定量限72.8供试品溶液的制备72.9 阴性对照溶液测定102.10精密度试验112.11稳定性试验

6、122.12重复性试验122.13 回收率试验132.14样品含量测定133讨论153.1 流动相的选择153.2 提取方法的选择153.3 测定波长的选择15参考文献16综述17致谢28前言参苓散为湘潭飞鸽药业有限公司独家品种，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第八册。参苓散的主要成分是：人参、茯苓、甘草、白术、党参等。因文献报道甘草苷1-4对大白鼠幽门结扎形成的溃疡有抑制作用，显示甘草苷成分与本品功能与主治“补气健脾，和胃渗湿”密切关联，故选择以“甘草苷”作为测定指标。现为提高的该药品的质量标准，加入了用高效液相色谱法测定药物中甘草苷的含量。 张崇禧等5用HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量

7、，并提出甘草苷在0.40.6g范围内具有良好的线性关系，r=0.9998，平均回收率(n=3)为 100.50，RSD =0.22。高玉峰等6用RPHPLC法测定了沙参止咳汤散中甘草苷含量，并提出采用 Shimpack VPODS(46mm×150mm，5m) 色谱柱，流动相为乙腈一05冰醋酸溶液(20：80)为流动相；流速 1.0mlmin-1，检测波长276nm，柱温为30。结果：甘草苷进样量在0.021.0 g范围内与峰面积线性关系良好，r=0.9999，平均加样回收率为96.75，RSD=1.08(n =6)。伍尉萍等7用HPLC法测定甘草中甘草苷的含量。本实验用HPLC法测

8、定参苓散中甘草苷的含量。1 实验材料1.1仪器仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪。检测器VWD色谱柱 Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)柱温 35色谱工作站 LC系统化学工作站1.2 试药参苓散（批号：081125），甘草苷（中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号：11610-200604）。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱Diamosil C18 (4.6mm×250mm×5m)，流动相：乙腈0.5冰醋酸（10：90）；流速：10 mlmin，检测波长：276 nm，柱温

9、：35 。2.2 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品18.54mg，置20ml量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（37.08µg/ml）。精密量取储备液5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（46.35µg/ml）。精密量取储备液1ml，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（0.0927µg/ml）。精密称取经五

10、氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品8.19mg，置25ml量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（16.38µg/ml）。精密称取经五氧化二磷减压干燥12小时的甘草苷对照品11.62mg，置25ml量瓶中，加入甲醇适量，振摇使溶解，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml， 10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（232.4µg/ml）。2.3 测定波长的确定 取上述对照品溶液，照紫外分光光度法，在200400nm范围内扫描（仪器：UV-2401PC Slit:1

11、.0；快速扫描），结果在275.8nm和218nm波长处有最大吸收，因考虑218nm为末端吸收，故选择276nm作为检测波长，见图2.1。图2.1甘草苷对照品溶液紫外光谱2.4流动相的选择 甲醇0.1磷酸(30：70）。甲醇0.5冰醋酸（30：70）。乙腈0.5冰醋酸（10：90）。| 分别采用上述三种流动相，精密吸取对照品溶液10µl，注入液相色谱仪，测定。其色谱峰结果见表2.1，其图见图2.2、2.3、2.4。 观察色谱峰峰形，以流动相的色谱峰对称性较好，且理论踏板数明显高于前两种流动相，故选择流动相。表2.1 流动相比较表流动相编号峰面积积分值理论板数拖尾因子907.44672

12、34420.62901.6517335590.63890.9583759910.96成分：甘草苷保留时间：32.1分钟理论板数：3442拖尾因子：0.62图2.2 流动相 对照品色谱图成分：甘草苷保留时间：35.0分钟理论板数：3559拖尾因子：0.63图2.3 流动相 对照品色谱图成分：甘草苷保留时间：24.5分钟理论板数：5991拖尾因子：0.96图2.4 流动相 对照品色谱图2.5 线性关系考察 精密吸取对照品溶液（37.08µg/ml）1、2、4、6、8、10l， 注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值为纵坐标，进样量（ng）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=1.942

13、9X-1.7405 R=0.9998。结果表明：甘草苷对照品在37.08370.8ng范围内线性关系良好，结果见图2.5、表2.2。图2.5 甘草苷标准曲线图表2.2 线性关系试验结果表进样量（ng）峰面积积分值37.0868.0649074.16146.80750148.32280.99387222.48434.69821296.64574.72278370.8717.565612.6 检测限 精密吸取对照品溶液（0.0927µg/ml）4l，注入液相色谱仪，测定，信噪比为2.3，故检测限为0.3708ng（图2.6）。图2.6 检测限2.7 定量限 精密吸取对照品溶液（0.092

14、7µg/ml）20l， 注入液相色谱仪，测定，信噪比约为10，故检测限为1.854ng。2.8供试品溶液的制备取本品（批号：081125）10袋内容物，混匀，备用。仪器与试药仪器：Agilent 1200 高效液相色谱仪检测器：VWD色谱柱：Agilent TC-C18( 250mm ×4.6 mm×5µm）流动相：乙腈0.5冰醋酸（1090）其余色谱条件同前。 提取溶剂的选择取上述粉末五份，每份约5g，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，依次精密加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、无水乙醇25ml，称定重量，密塞，超声处理（300W，25kHz）30

15、分钟（时时振摇），放冷，称重，分别用各溶剂补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定并计算，结果见表2.3。表2.3 提取溶剂选择结果比较表编号取样量（g）提取溶剂峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（mg/g）4.9790水170.13638169.376250.0411168.616125.120830乙醇299.80957299.743780.0707299.677985.055750乙醇364.58862364.235960.0870363.88335.065670乙醇327.

16、71307328.850690.0784329.988315.0145无水乙醇37.0644536.772210.008836.47997结果表明，用上述溶剂提取供试品，以50乙醇测得含量结果最高，因此选择以50乙醇为提取溶剂。提取时间的考察 取上述粉末四份，每份约5g，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理（300W，25kHz）15分钟、30分钟、45分钟、60分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法：密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定

17、，并计算，结果见表2.4。表2.4 提取时间选择结果比较表编号取样量（g）提取时间峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（mg/g）5.009915分钟349.19781347.752140.0838346.306465.099230分钟353.75717354.744650.0840355.732125.055745分钟364.58862364.235960.0870363.88335.016860分钟361.6655363.037770.0874364.41003结果表明，15分钟和30分钟所得的提取得率稍低，45分钟和60分钟所得的提取得率相近，因此提取时间选择为45分钟。2.8.4提取方法

18、选择 取上述粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（300W，25kHz）45分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。表2.5 提取方法选择结果比较表编号取样量（g）提取方法峰面积积分值峰面积积分值平均值含量（mg/g）5.0557超声处理45分钟364.58862364.235960.0870363.883305.0853回流提取45分钟331.59070332.25620.0789332.92169取上述粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，称定

19、重量，回流提取45分钟，放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。测定法 精密吸取对照品溶液及各供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定并计算，结果见表2.5。结果表明，超声提取方法测得含量结果较高，故选择超声处理为提取方法。综合上述三个方面的考察结果，确定供试品溶液制备方法为：取本品装量差异下的内容物混匀，取约5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇25ml，密塞，称定重量，超声处理（300W，25kHz）45分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液，即得。2.9

20、 阴性对照溶液测定 按处方称取除甘草外的其余各药材，制成缺甘草的阴性对照样品，同法制成缺甘草的阴性对照溶液，依法测定。图2.7 阴性对照溶液色谱图成分：甘草苷保留时间：26.0分钟理论板数：5578拖尾因子：0.83图2.8 样品溶液色谱图成分：甘草苷保留时间：25.8分钟理论板数：5283拖尾因子：0.91成分：甘草苷保留时间：43.8分钟理论板数：5983拖尾因子：0.83图2.9 对照溶液色谱图结果：阴性对照溶液的色谱图中，在与甘草苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，说明阴性样品无干扰（图2.7、2.8、2.9）。2.10精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，进样6次，每次10l，依法

21、测定，其甘草苷峰面积积分值的RSD为1.3，结果表明仪器精密度良好，见表2.7。表2.7精密度试验结果表编号峰面积积分值平均RSD(%)1349.70570355.007431.32356.845583349.457064357.296055361.344856355.395362.11稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后的0、1、2、4、6、8、10、12小时，精密吸取10l，注入液相色谱仪，测定，结果见表2.8。结果表明：供试品溶液在配制后12小时内稳定。表2.8 稳定性试验结果表时间（h）峰面积积分值平均峰面积RSD(%)0349.70570355.40667131.21356.84

22、5582349.457064357.296056361.344858355.3953610358.2765512354.932222.12重复性试验 表2.9 重复性试验结果编号取样量（g）峰面积积分值峰面积积分值平均值测定结果（mg/g）平均值（mg/g）RSD(%)5.0140349.70157348.178740.08380.08551.5346.655915.0095351.94305350.850540.0846349.758035.0252352.46164353.784700.0850355.107765.0260360.98734359.202500.0863357.41766

23、5.0102361.72195361.363250.0871361.004555.0385360.21237361.022840.0865361.83331取同一批号（0704016）样品6份，依法制备供试品溶液并测定，结果见表2.9。结果表明：本方法重复性较好。2.13 回收率试验 取已测定含量的同一批号（081125）样品粉末（含甘草苷0.086mg/g）约2.7g，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中，各精密加入对照品溶液（232.4µg/ml）1ml，回收溶剂至干，放冷，依法制备供试品溶液，测定并计算。结果见表2.10。结果表明：本方法加样回收率较好。表2.10 回收率试验结果表

24、编号取样量（g）样品中甘草苷含量（mg）添加甘草苷量（mg）实测甘草苷量（mg）回收率（%）平均回收率(%)RSD(%)12.73990.23560.23240.465999.0101.61.922.79810.23780.4783103.432.75210.23390.4738103.242.75480.23690.4750102.452.77870.23890.4772102.562.75210.23660.467799.42.14样品含量测定 对湘潭飞鸽药业有限公司提供的样品（081125、0704016、0704026、0704036）进行含量测定，结果见表2.11。该品种因市场原因，

25、生产单位很少生产，上述四批样品为生产单位为提高行动计划研究工作生产。以上四批样品甘草苷平均结果为0.032mg/g，按平均结果约75计算，暂定本品每1g含甘草以甘草苷（C21H22O9）计，不得少于0.025mg。 按中国药典2005年版一部“甘草”项下限度规定，计算理论转移率为11.2。表2.11 参苓散中甘草苷含量测定结果批号取样量（g）峰面积积分值峰面积积分值平均值测定结果（mg/g）测定结果平均值（mg/g）0811255.0140349.70157348.178740.0830.083346.655915.0095351.94305350.850540.084349.75803070

26、40165.016864.5158664.9920550.0150.01565.468250.0155.038166.1172666.425400.01566.733540.01507040264.975566.5174966.5064150.0160.01666.495340.0165.030366.3602967.1679250.01667.975560.01607040364.973167.4366168.056130.0160.01668.675650.0165.002269.0873468.952720.01668.818100.0163讨论3.1 流动相的选择流动相分别试验了甲醇0

27、.1磷酸(3070），甲醇0.5冰醋酸（3070），乙腈0.5冰醋酸（1090）.经试验采用乙腈一0.5molL冰醋酸(10:90)系统时，甘草苷能够与其他成分有效分离，且峰型较好。3.2 提取方法的选择取上述粉末四份，每份约5g，各精密称定，分置具塞锥形瓶中，精密加入50乙醇25ml，密塞，称定重量，分别超声处理（300W，25kHz）15分钟、30分钟、45分钟、60分钟（时时振摇），放冷，用50乙醇补足减失的重量，摇匀，离心（8000转/分钟，15分钟），取上清液。结果表明，15分钟和30分钟所得的提取得率稍低，45分钟和60分钟所得的提取得率相近，因此提取时间选择为45分钟。3.3 测

28、定波长的选择 取甘草苷对照品溶液，照紫外分光光度法，在200400nm范围内扫描（仪器：UV-2401PC Slit:1.0；快速扫描），结果在275.8nm和218nm波长处有最大吸收，因考虑218nm为末端吸收，故选择276nm作为检测。该方法以乙腈0.5molL冰醋酸(10:90)为流动相，采用超声提取的方法测定甘草中甘草苷的含量，实验简单、精密度高，结果准确可靠，可作为参苓散中甘草苷含量质量控制的一种有效方法。参考文献1 中国药典一部M2005：592 彭励，胡正海甘草生物学及化学成分的研究进展J中草药，2009， 36(11)：174417473 Zhang J，Yao J，Yang

29、YL。Analysis and Mensurate Contents of Alkaloid in liquoriceJAeta Bot Boreal Oecidant Sin，2001，21(5)：12591262 4植物药有效成分手册M 人民卫生出版社，1986年第一版：6735张崇禧，杨春花，蔡恩博.HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量，中国中药杂志。2008，28(7)：5935976高玉峰，巴图德力根，青玉. RPHPLC法测定沙参止咳汤散中甘草苷含量，中国中医药科技，2010，5（17）：232-2337 伍尉萍，阎宏涛，孙文基.HPLC法测定甘草中甘草苷的含量J.药物分析杂志，2

30、004，24（4）：425综述国内甘草苷测定方法研究进展摘要综述了近年来国内甘草苷测定方法研究概况，系统介绍了目前国内常用的甘草苷含量测定方法:高效液相色普法、反相高效液相色谱法、薄层扫描法等，并预测了甘草苷测定方法未来的发展趋势。关键词甘草苷；含量测定；方法；综述甘草为豆科甘草属植物，其根茎是常用的中草药和经济植物1 ，素有“国老”之称。甘草具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的作用。现代药理研究证明，甘草具有抗炎、抗变态反应、抗溃疡、抗HIV、诱生干扰素、调节细胞免疫功能、抗癌等作用2 。甘草苷作为甘草中的主要有效成分，在医药、食品、化妆品、卷烟等行业有着极其广泛的应用3

31、。甘草及其产品中常以甘草苷作为定量指标，用于评价药材、成药的质量，制剂稳定性的优劣，制订药品质量标准等4 。甘草配方品种繁多，成分多样，而且含量变化不一，即使同一配方的药物，因产地、栽培方法、生长环境和采收季节的不同，其成分及含量相差很大。甘草有效成分的分析测定是一项复杂而艰巨的工作。因此，见诸于文献的甘草苷含量定量分析方法有很多，主要有:原子吸收法、一次展开二维薄层色谱电泳法、小波变换二次微分示波计时电位法、薄层紫外分光光度法、双波长薄层扫描法、薄层层析法、离子抑制色谱法、重量法、RP- HPLC 法、比色法、极谱催化波法、高效液相色谱气相、色谱法等。近几年来，高效毛细管电泳法、高效液相色谱

32、法和RP - HPLC 法应用比较广泛，尤其是应用高效液相色谱法定量分析甘草苷含量发展迅速。1高效液相色谱法20 世纪60 年代， 在Horvath Lipsky ， Kirland 和Huber 等人研制出高效液相色谱(HPLC) 仪后，由于HPLC 和其它分离方法相比具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重复性好和操作方便等优点，很快就在中草药化学研究中得到了广泛的应用，随着HPLC 方法的发展和完善，现在已成为中草药化学中不可缺少的主要分离方法之一5 。在甘草苷测定过程中，应用最广泛的是分析型HPLC。蓝煜6采用高效液相色谱法测定独活寄生丸中甘草苷含量的结果表明，方法准确，快速，

33、可靠。仪器为岛津LC - 6A 高效液相色谱仪;SPD - 6AV 紫外检测器;色谱条件: Inertsil ODS - 2(5 mm，4. 6 ×250 mm) ;流动相:水乙腈(8515) ; 检测波长230 nm; 流速0. 8 mL/min ;柱温30 。范吕林7采用高效液相色谱法测定复方甘草合剂中甘草苷的含量，结果较为满意。研究时应用美国Waters 公司高效液相色谱系统，色谱条件:色谱柱Nova - PakC18 (4m，3. 9 ×150 mm) ;流动相为水乙腈醋酸(63372) ;检测波长254 nm;流速1. 0 mL/ min ;柱温30 。梁月琴等8

34、用高效液相色谱法测定甘草及其制剂中甘草苷含量，发现此法提取简单，测定迅速，精密度较好。使用设备为美国Perkin- Elmer 液相色谱仪，LC - 235C 紫外检测器，1022 LC数据处理仪，Waters 不锈钢色谱柱NOVA PAKTMC18 (5m) 3. 9 mm×150 mm，流动相为甲醇0. 066 mol/ L 乙醇溶液(65 :35) ，流速1 mL/ min ，检测波长155 nm。张和平等9建立了一种简便、快速测定血液中微量甘草苷含量的HPLC 法，该方法利用的是Beckman 高效液相色谱系统，色谱条件:流动相为甲醇水乙腈冰乙酸(6023161) ，流速1

35、mL/ min ，紫外检测波长252 nm，量程0. 2 AUFS。色谱柱:ODSC18柱(250mm×4. 6 mm) 。张继等10通过HPLC 法对刺果甘草进行的甘草苷定量分析，为甘草的质量评价提供了依据(美国Varian 公司5000 型高效液相色谱仪，美国Varian 公司CDS401 型数据处理机，Pak SPMCH- 5 ，4.0 mm×150 mm 不锈钢色谱柱，流动相为70 %甲醇:30 %水:0. 5 %冰乙酸。机温30 ，流速1. 0 mL/ min ，紫外检测器波长254 nm) 。宋洪杰等11采用高效液相色谱法测定胃脘舒冲剂中甘草苷的含量，以对羟基苯

36、甲酸丁酯为内标物，甲醇水36 %醋酸(652 87) 为流动相，Shimpack CLC ODS 柱(60 mm×150 mm) ，流速10 mL/ min ，检测波长254 nm。曹爱兰等12建立了高效液相色谱测定方法，测定了54 份样品。仪器为日立638 - 50 型高效液相色谱仪，635M多波段紫外检测器，色谱柱PRC184. 6 mm×220 mm，10m，流动相为甲醇水36 %醋酸(71281) ，流速1 mL/ min ，检测波长250 nm。王荣等13运用高效液相色谱法系统地对7 种不同剂型的甘草复方制剂中甘草苷的含量进行测定 以Zorbax - ODS (4

37、. 6 mm ×25 cm) 为固定相，流动相为乙腈1 mL/ L 乙酸(3362) ，紫外检测波长为238 nm ，实验表明，运用HPLC 对甘草复方制剂中的甘草苷进行质量控制的结果是可信的，令人满意。米慕真等14以HPLC 外标工作曲线法，选择ODS色谱柱，甲醇四氢呋喃1 %醋酸(37. 217. 944. 9)为流动相，对甘草的6 个品种的24 个样品进行了含量测定，结果表明，不同品种、不同产地的甘草中甘草苷含量差异较大。崔铉玖等15采用韩国盈仁科学仪器公司高效液相色谱仪色谱柱- Bondapack C18 ， 3.9 mm×300 mm，流动相为乙腈(1. 5 mo

38、l/ L) 冰醋酸水溶液(3565) ，紫外检测波长254 nm测定了芎芷香苏散流浸膏中甘草苷的含量，结果表明，本方法操作简便，被测成分分离完全，测定结果准确。马德明等16用美国SP8810 高效液相色谱仪 SP8450 检测器，ODS(4. 6 mm×150 mm) 色谱柱，流动相CH3CN NaH2PO4缓冲液(4070) ，检测波长254 nm测定精致银翘解毒片中甘草苷的含量，发现该方法具有良好的稳定性，方法可靠。邵国良等17 采用美国Waters高效液相色谱仪(色谱柱C18 (5) 150mm ×5mm ，流动相:甲醇水36 %醋酸(68320. 5) ，检测波长2

39、54nm) 测定克尔迈口服液中甘草苷的含量，实验结果表明，结果稳定，操作简便，测定迅速。杜海燕等18采用日本岛津LC - 6A 高效液相色谱系统ODS 分析柱(4. 6 mm×150 mm) ，流动相为0. 05 mol/ L KH2PO4 (pH= 2. 5) MeCN(2110) ，检测波长254 nm测定牛黄清心丸中甘草苷含量，结果表明，该方法简便，准确。朱兰等19采用美国Waters 高效液相色谱仪(色谱柱:Bondapak C18 ，3. 9 mm ×300 mm;流动相为甲醇1. 5mol/L 冰醋酸水溶液(6832) ;检测波长254 nm) 测定胃脘舒冲剂中

40、甘草苷的含量，其方法简便、准确、重现性好。刘荣华等20采用高效液相色谱仪(U. S. A)Waters - 510 双泵，U6K进样器，996 (PDA) 检测器(U.S.A) ，Millenni - um2010 V2. 0 色谱管理系统，色谱柱:Nova - Pa KC183. 9 mm×150 mm，401m。流动相为甲醇水(7030) ，用冰醋酸调至pH = 56 ，检测波长254 nm测定炙甘草汤中甘草苷含量，为中药的复方制剂研究提供了实验依据。虽然高效液相色谱法是最常用的分析手段，有很多优点，但目前仍需对其中一些重要内容加以研究，如长期自动化操作后其可信程度的保护、自动获

41、取数据系统的建立、评价和识别偶然干扰以及测定专属性药物时进行的条件优化等。2 反相高效液相色谱法反相高效液相色谱是HPLC 中应用最广泛的一个分支，其操作方便，稳定性和重复性好，价格便宜。用作流动相的水以及能与水互溶的有机溶剂在价格和获取方便的程度上都比正相色谱中的烃类溶剂有利。特别是化学键合固定相上样品的不可逆吸附和溶剂的记忆效应小，使得极性组分以及在甲醇或乙腈中可溶解的非极性和弱极性组分在反相HPLC 体系中都能有很好的溶解度和分离效率，更为突出的是分析对象多样化，灵活性大21 。近年来，反相HPLC 在甘草制剂质量控制中的应用得到了迅速发展。朱维华等22应用Waters 高效液相色谱仪6

42、000A型高压泵U6K进样器，PSD - 1 型可调波长UV/ vis 检测器，CR - 1B 微处理机。色谱柱YWGC1810m，不锈钢柱(3. 9 mm ×250 mm) ，流动相为乙腈甲醇水(含有1. 05 %HAc) (501585) ，检测波长248 nm分析了甘草苷含量很少的太阳神口服液，结果表明这种方法简单、快速。王兰霞23利用Sp - 8800 型高效液相色谱仪美国Spectra Physics) ，色谱柱为RP - 18 (220mm×4. 6 mm，5m，美国Spectra Physics) ，流动相为水乙腈醋酸(36372 ) ，流速1. 5 mL/

43、min ，检测波长254 nm测定了五味沙棘口服液中甘草苷的含量，结果表明这种测定方法操作简便、分析快速、重现性良好，可作为原料、中间体及制剂的质量控制手段。汪国华等24采用美国Waters 液相色谱仪510 型恒流泵，996(PDA) 检测器，U6K进样品，Millennium2010V. 2.0 色谱管理系统，色谱条件:YWG - C18柱，200 mm ×4mm，10m，G(4) - ODS 保护柱;流动相:甲醇水0.2 %冰醋酸 (7030) ，pH = 5 ，流速1. 0 mL/ min ，检测波长249 mm测定了复方炙甘草颗粒中甘草苷的含量，结果表明这种方法可消除样品中

44、阿胶等其他中药成分及辅料的干扰，操作简便，结果准确，重现性好。杨义芳等25 应用日本Waters 公司的201 型液相色谱仪色谱柱YGWC18 (300 mm ×4 mm ，粒径10m) ，流动相为甲醇1 %醋酸(6832) ，柱温35 ，检测波长254 nm测定了胖大海口含片中甘草苷的含量，表明本法灵敏、快速、准确、专属性强、重现性好。马鹏等26 用反相高效液相色谱法测定了各中成药中甘草苷的含量。仪器为日本岛津LC - 9A 高效液相色谱仪，包括SPD - 6AV 紫外可见检测器，C - R4A 数据处理机，SCL - 6B 自动进样品，CQ - 250 超声振荡器，分析柱为Shi

45、mpack CLC ODS(6. 0 mm×150 mm) ，流动相为甲醇水(6337) (含0. 005 mol/ L TBAH， pH= 6.5) ，检测波长为254 nm。在该色谱条件下，作为甘草的确认峰，该峰尖锐，对称，可进行定量测定。马鹏等27用反相高效液相色谱法测定葛根芩连汤的甘草苷含量，结果满意。仪器为日本岛津LC - 9A 高效液相色谱仪，SPD - 6AV 紫外可见进样器;C - R4A 数据处理机;色谱柱:Shimpack CLC ODS(6. 0 ×150 mm) ;流动相:甲醇水(6535) ，含0. 005 mol TBAH，磷酸调pH= 6. 5

46、 ，检测波长254 nm。荣志芬等28采用RP -HPLC- UV 方法测定了复方止咳冲剂中甘草苷的含量，结果良好。仪器为Varian HPLC 系统，9010 泵，9050 - UV 检测器;色谱柱C18 (3. 9 mm ×25 cm) ，流动相为CH3OH(0. 5 %HAc) H2O(0. 5 %HAc) = 25 :7 ，检测波长254 nm。官曙光等29采用LC - 6A 高效液相色谱仪(日本岛津) ，用反相高效液相色谱法测定桂甘胶囊中甘草苷的含量(以Resolve ODS 柱为分析柱，流动相为甲醇水醋酸(69310. 5) ，检测波长254nm) ，方法简便可靠，精密度

47、高。刘宝玲30应用岛津LC - 6A 型高效液相色谱仪， Inertsil ODS - 25 柱(5m、4. 6 mm×250 mm) ，日本岛津SPD - 6AUV 检测器采用反相高效液相色谱法测定双料参茸中甘草苷的含量，流动相为含有0. 005 mol/ L TBAH(四丁基铵) 水甲醇(3862) ，以磷酸调pH= 6. 0 ，检测波长254 nm，在这样的条件下，甘草苷得到较好的分离，方法重现性好。倪坤仪等31用反相高效液相色谱法测定了银翘解毒片中有效成分甘草苷的含量，该法准确、可靠，重现性好。仪器为Waters 高效液相色谱仪，510 高压泵，490 紫外可见波长检测器，7

48、40 数据处理机。色谱柱:YQGC18 柱(3. 9 mm ×200 mm，5m) ，流动相为乙腈水(4951 ) ，甘草苷检测波长248 nm。杨吉田等32用反相高效液相色谱法对止痛胶囊中甘草苷含量测定方法进行了研究，仪器为日本岛津LC - 6A 型高效液相色谱仪，SPD - 6AV 可调波长检测器，色谱柱为岛津Shim- pack clc - ODS6 ×150 mm，流动相:甲醇水36 %醋酸溶液(65287) ，检测波长:254 nm。实验结果证明，本法测定止痛胶囊中甘草苷的含量，方法简单、快速、容易，结果准确。王静竹等33以甘草苷单铵盐标准品为对照，应用反相高效液

49、相色谱法测定了甘草及其炮制品中甘草苷的含量，所用仪器为Waters 高效液相色谱仪，510 型泵，490E 型紫外检测器，色谱柱为- Bondapak C18柱(3. 9 mm ×15cm) ，流动相为甲醇水醋酸(67267) ，检测波长为256 nm。结果表明该方法准确度高，重现性好，操作快速、简便。尽管反相高效液相色谱法有其优点，但也存在着弊病，即分析时间长、试剂成本太高。此外，该技术的应用受到限制的最大原因是需要标准样品才能定性。在实际使用中还需要考虑延长色谱柱的使用寿命问题。3 薄层扫描法薄层扫描法(TLC - Scanning method) ，是薄层色谱技术与光密度计和微

50、型电子计算机结合起来的一种新型仪器分析方法。应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定，简便快速、灵敏准确、专属性好34 。袁珂等36 应用CS - 9301 薄层扫描仪(日本岛津) ，采用薄层扫描法测定复方冬凌草含片中甘草苷的含量，操作简便，不用显色剂即可在紫外灯(254 nm) 下定位，色斑清晰，显紫红色斑点，实验方法灵敏可靠。何桂霞等37 采用薄层扫描法测定开胃健脾胶囊中甘草苷的含量。展开剂正丁醇冰醋酸水(613) 上层液，测定波长为252 nm ，参比波长500 nm ，方法简便、快速，可作为该制剂质量控制标准。吴容军等38 采用薄层扫描法测定术苓口服液中甘草苷的含量(日本岛津

51、CS930 型薄层扫描仪，扫描条件测定波长252 nm ，散射参数SX =3 ，反射法锯齿扫描) 。这种方法可靠，重现性好，被认为可作为该制剂内在质量的控制标准。王立新等39 ，采用薄层扫描法对十全大补丸中的活性成分甘草苷进行了测定，结果表明方法简便，准确可靠。虽然薄层扫描法也是一种较好的分离方法，但影响薄层扫描结果的因素较多，而且分辨率不高，限制了它的应用。因此使用时要求应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。此外，甘草苷的定量测定还可以采

52、用薄层比色法35 、双波长薄层扫描法测定40 、小波变换二次微分示波计时电位法41 、离子抑制色谱法42，43 、极谱催化波法44，45 、气相色谱法53 等。通过对以上几种方法的比较，可以看出HPLC作为一种广泛、有效的分离手段，在甘草有效成分分析中有很好的应用前景。它的微量，解决了甘草有效成分提取的困难。它的高效，使甘草复方中多种成分的同时分离成为可能，它的快捷提高了分析效率。可以相信，HPLC 作为一种强有力的分析技术，势必在甘草有效成分分析中发挥更大的作用。甘草有效成分分析分离方法的着眼点应放在实用、易推广和快速，而且操作要简单，适用于常规分析和自动化操作上。因此，在分析方法的选择上应

53、具有明显的时代性，应尽快地采用新技术新方法。近年发展起来的热分析法、X - 射线衍射法等得到了人们的广泛关注，有待去努力开拓。为了适应和推动甘草有效成分测定的需要和发展，甘草有效成分的测定仪器还必须是具有高灵敏度(达原子级、分子级水平) 、快速、自动、简便、经济的特性，并可以通过提高信噪比来提高甘草有效成分测定仪器的灵敏度。随着现代分析化学的发展，甘草有效成分的测定仪器也需要向痕量与超痕量分析( ng/ g 至pg/ g 以及fg/ g 和ag/ g 甚至zg/ g) 的方向发展，这将推动甘草有效成分测定仪器的技术进步。21 世纪甘草有效成分测定技术发展的主流是应用先进的科学技术研究建立有效而实用的原位(in situ) 、在体( in vivo) 、实时( real line) 、在线(online) 和高灵敏度、高选择性的新型动态分析测定方法，实现甘草有效成分测定分析仪器的微分析系统(- TAS) 化，并向微型化、智能化方向加速发展。希望随着科学技术的发展，测定手段的完善，人们还能寻找出最简便，灵敏度高，最可行的甘草苷定量测定方法。参考文献1 傅克治. 中国甘草野生变家植. 哈尔滨:东北