聚丙烯酰氨凝胶电泳

1、聚丙烯酰氨凝胶电泳作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是 非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因 素分开：蛋白大小，形状和电荷。而SDS-PAG仅根据蛋白分子量亚基的不同而别离蛋白。这个技术首先是 1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中参加离子去污 剂和强复原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以无视。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的 氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二。三级结构。而强复原剂如巯基乙醇， 二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间

2、的二硫键断裂。在样品和凝胶中参加复原剂和 SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电 荷差异和结构差异。SDS-PAG一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较 高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在 浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯 离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。 蛋白质带负电荷，因此一起向正极移 动，其中氯

3、离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率 最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因 而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面， 使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAG，)olyacrylamide gel electrophoresis )方法可对蛋白质的组分进行别离，并可精确测得蛋白质的分 子量。常用的方法为SDS-PAG不连续系统。根本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺(acrylamide )和N,N-亚甲基双丙 稀酰胺(N,N -

4、methylene bis acrylamide )经共聚合而成。此聚合过程是由四 甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEME)和过硫酸胺(ammoniumpersulfate , AF)激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸， 正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立 体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰 胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品在高温(120C)烹调下容易产生丙烯酰胺。研究说明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多

5、种途径 接触丙烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化 道吸收最快。 进入人体内的丙烯酰胺约 90被代谢， 仅少量以原形经尿液排出。 丙烯酰胺进入体内后，会在体内与 DNA上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致遗传 物质损伤和基因突变。对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调 查说明，丙烯酰胺具有神经毒性作用，但目前还没有充足的证据说明通过食物 摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显关系。丙烯酰胺简介丙烯酰胺是一种有机化合物，别名 AM纯品为白色结晶固体，易溶于水、 甲醇、乙醇、丙醇，稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解 成

6、丙烯酸。职业性接触主要见于丙烯酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成，在地 下建筑、改进土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也有接触时机。日常生活中， 丙烯酰胺可见于吸烟、经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中。N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名 MBA双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双 丙烯酰胺，N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。 遇高温或强光那么自交联，微溶于水、乙醇。丙烯酰胺单体和交联剂N1 N -亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成 含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三 维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。N, N - 亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯

7、酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色 或浅黄色粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙 醇、丙酮等有机溶剂。 在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反响性官能团 , 可作为交联剂 , 能将线性高分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 还可与各种离子型单体发生聚合反响 , 使其在石油开采以及医药、水处理等行 业具有广泛用途。产品简介：? TEMED即卩 N,N,N ,N -Tetramethylethylenediamine ，中文名为 N,N,N,N -四甲基二乙胺。分子式为 (CH3)2NCH2CH2N(CH3，)2 分子量为 116.20 。?进口分

8、装，用于配制PAGE交等。TEMEGS过催化过硫酸铵形成自由基而 加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。?参加加速剂TEME后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶保存条件：4C保存考前须知：? 易燃，有腐蚀性，请注意防护。 ?为了您的平安和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。过硫酸铵 分子式: NH42S2O8 分子量: 228.20 性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发剂。它几乎不吸潮，由于能到达很高的纯度而具有特别好的稳定性， 便于储存。另外，它还具有使用方便、平安等优点。储存及使用考前须知：过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在

9、一定条件下储存。首先必须存放在枯燥、密闭的容器中，其次应防止阳光直射、 热源、潮湿等不利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及复原剂 可能引起过硫酸铵的分解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫 酸铵粉末及其水溶液有漂白和轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应防止眼睛、 皮肤和衣物直接与其接触。过硫酸铵的应用：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的 自由基。须新鲜配制。 过硫酸铵是乳胶或丙烯酸单体聚合液、醋酸乙烯、氯乙 烯等产品的引发剂，同时也是苯乙烯、丙烯腈、丁二烯等胶体发生共聚作用的 引发剂。过硫酸铵-TEME四甲基乙二胺系统：在Acr和Bis的溶液中放入这个 催化系统

10、后，过硫酸铵NH4 2S2O8产生出游离氧原子使单体成为具有游离 基的状态，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。 这种催化系统需要在碱性条件下进行。例如，在 pH 8.8 条件下 7的丙烯酰胺 溶液 30 分钟就能聚合完毕；在 pH 4.3 时聚合很慢，要 90分钟才能完成。温度 与聚合的快慢成正比。通常在室温下就很快聚合，温度升高聚合更快。如将混 合后的凝胶溶液放在近0C的地方，就能延缓聚合。一般来讲，温度过低，有氧 分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子 而阻碍聚合，在聚合前须将溶液分别抽气，然后再混合。十二烷基硫酸钠 SDS不连续系统

11、由上层浓缩胶和下层的别离胶组成。浓缩胶pH6.7,孔径大主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入别离胶前，被浓缩成很窄的条带，从 而提高别离效果。别离胶pH8.9，孔径小通过分子筛效应和电荷效应，把样 品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。 如果要利用凝胶电泳测定某一蛋 白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠(SDS 。 SDS是一种阴离子去污剂。在电泳体系中参加一定浓度的SDSSDS以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低

12、或消除了各种蛋白质分子天 然电荷的差异。是阴离子型外表活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的 复合物，再与PAG战术结合，那么谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分 子量。在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS-PAG只是按照分子大小别离的，而不是根据分子所带的电荷和大小别离的。SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白 质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋 白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。甘氨酸最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein(1964) 和 Dav

13、is(1964) 设计的 , 样品和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含 Tris- 甘氨酸 (pH 8.3), 别离胶中含 Tris-HCl(pH 8.8) 。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970) 。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘 氨酸分子那么组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度 较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在别离胶前沿积聚。 此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子 之后，沿别离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS蛋白质复合物成一电位和

14、pH值均匀的区带泳动穿过别离胶，并被筛分而依各自的大小得到别离。浓缩效应：凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为别离胶。 浓缩胶为大孔胶，缓冲液PH6.7，别离胶为小孔胶，缓冲液pH8.9。在上下电泳 槽内充以Tris 甘氨酸缓冲液(pH8.3)，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液 pH值 的不连续性。在浓缩胶中 HCl 几乎全部解离为 Cl- ，但只有极少局部甘氨酸解 离为H2NCH2COO蛋白质的等电点一般在pH5左右，在此条件下其解离度在HCI 和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这 3种离子同向阳极移动。其有效泳动率 依次为Cl- 蛋白质H2NCH2COO-故C1-称为快离子，而Gly

15、-称为慢离子。 电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导 与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白 质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成个稳定而不 断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此 蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋 白质浓缩数百倍。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳根本原理 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分、 pH值和凝胶孔径， 而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀。由此产生的 浓缩效应、电荷效应 和分子筛效应 。1浓缩效应 样品在电泳开始

16、时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层 一般 能浓缩几百倍 ，然后再被别离。当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大 的CI有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质那么尾随其后，解 离度最小的甘氨酸离子 PI=6 0泳动速度最慢，被称为慢离子。由于快离子的 迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。电导与电势梯度成 反比，因而可产生较高的电势梯度。这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离 子后面加速移动。因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界 面，由于 样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间 ，所以，也就聚 集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的

17、别离胶时，已形成一 薄层。2电荷效应 当各种离子进入 pH89 的小孔径别离胶后，甘氨酸离子的电泳迁 移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的别离胶中，由于各种蛋白质的 等电点不同 ，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不 同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。 3分子筛效应 由于别离胶的孔径较小， 分子量大小或分子形状不同 的蛋白质 通过别离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被别离。此处分子 筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面， 大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。 毒性丙烯

18、酰胺属中等毒类， 对眼睛和皮肤有一定的刺激作用， 可经皮肤、呼吸道和消化道吸收，在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分 罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒，中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以 及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢性中毒，中毒者出 现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、脱屑， 手掌、足心多汗，进一步开展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。 丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用， 可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发 现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢 神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有充足的人群流行病学证据 说明，食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性。国际癌症研究机构IARC对其致癌性进行了评价，将丙烯酰