坦布苏病毒简介

1、坦布苏病毒简介1、坦布苏病毒病概述2010年4月以来在我国大部分养鸭地区发生了一种以传播迅速、突发性的产蛋急剧下降为主要特点的新鸭病。临床主要表现为：产蛋鸭产蛋严重下降，产蛋率从90降至10以内，甚至绝产，给养鸭业造成了严重的经济损失(李玉峰，2011)。该病最初命名为“鸭出血性卵巢炎”， “鸭病毒性脑炎”，“鸭产蛋下降综合症”，“鸭传染性卵巢炎” (黄欣，2011；李玉峰，2011；廖敏等，2011)等。苏敬良等从病鸭中分离出了一种新型黄病毒，并命名为BYD病毒，属于在鸭上首次发现。2012年该病被确诊是鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)。到目前为止，更有报道本

2、病在蛋鸡、鸡群及鹅群(傅光华等，2011；黄欣梅 ，2011)中发现。关于本次在鸭上传播的鸭黄病毒，病毒学家，法国马赛第二大学的访问学者Ernest Gould表示，由蚊子造成的传播不应该是一种必然的结果，并指出这种病毒传播期间的温度变化与由蚊子传播的其他黄病毒并不一致。（鸭子在早春的寒冷气候中开始患病，而推测起来，蚊子种群在此时还很虚弱，而疾病的暴发则会一直持续到秋季。）鉴于该病为鸭群新发生的疫病，除该病的病原学外，其致病机理、免疫机理、快速诊断技术和防制措施等，都有待进一步深入研究。2、病原学鸭出血性卵巢炎的病原与恩他耶病毒群的坦布苏病毒(Tem-busu virus，TMUV)印尼和泰国

3、病毒株的核苷酸同源性为87%91%，氨基酸同源性为98%99%；而与同群的Ntaya病毒、Sitiawan病毒、Theiler's murine encephalomye-litis virus(TMEV)、Bagaza病毒的核苷酸同源性大于70%，国际上对黄病毒属成员的分类标准为NS5基因3'端长约1 kb的区域中同种病毒的核苷酸序列同源性大于84%。因此确定该病原为黄病毒科黄病毒属恩他耶病毒群的TMUV。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）属于黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus）。TMUV的病毒粒子直径4050n

4、m，有脂质囊膜（胡旭东等，2011）。病毒基因组为单股正链RNA，大小为10.9kb。2.1 病毒基因组结构鸭坦布苏病毒基因组为不分节段的单股正链RNA，分子量约为3.8×106 (Shustov, A V et al., 2007)，由10990个核苷酸构成(Yun, T et al.,2012)。病毒基因组由3非编码区（3untranslated region，UTR），5非编码区（5non-coding region，NCR）及一个开放性阅读框（open reading frame，ORF）组成。3非编码区由618个核苷酸构成，与其他黄病毒不同，3非编码区还含有一个poly（A

5、）尾，包括起始、调节基因组复制和转录的保守二级或三级RNA元件。5非编码区由94个核苷酸构成，在黄病毒属中该结构保守性较差，其主要功能是在RNA复制过程中作为正链合成的起始位点。病毒基因组的开放性阅读框（ORF）包含10230 nt，编码一个大多聚蛋白，由3426个氨基酸构成，可以裂解为3个结构蛋白（C、M、E蛋白）和7个非结构蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5）(Mukhopadhyay, S et al.,2005)。E、NS1、NS3、NS5蛋白具有保守性和抗原性。C蛋白的氨基酸同源性低，含有大量的碱性氨基酸，参与病毒组装过程。E蛋白是DFV主要表面蛋白

6、，具有促使病毒与宿主细胞结合及膜融合功能，能诱导产生中和抗体。DFV的非结构蛋白NS1是黄病毒中最大的，是病毒感染过程中产生的主要免疫原，但NS1免疫不能诱导无明显的抗病毒抗体产生，发生抗体增强效应的可能性较小(Tang Y，et al.,2011)。NS3蛋白具有丝氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶/RNA解旋酶活性，参与蛋白质水解加工及病毒复制，与病毒的致病性密切相关(郑杰，2007)。NS3与NS2组成病毒复制体，感染动物可产生抗NS2-3抗体，但抗NS2-3抗体不具有病毒中和活性(郑杰，2007)。基因组RNA就是DTMUV特异性RNA，具有感染性、携带全部遗产信息、在病毒增殖过程中，直接起mR

7、NA作用，既可复制子代RNA，又可翻译出病毒蛋白。2.2 生物学特性TMUV对乙醚及去氧胆酸盐敏感。56加热15分钟灭活。最适pH为8.0-8.5，pH10以上使其灭活。对酸敏感。TMUV在胰酶处理后，感染性丧失。鸭坦布苏病毒可以在鸭胚、鸡胚、鸭胚成纤维细胞及部分传代细胞系如Vero细胞中繁殖。将鸭坦布苏病毒经尿囊腔接种鸡胚和鸭胚，3-5d后可致鸡胚和鸭胚死亡。接种CEF盲传5代不会产生病变，而将鸭源胚毒第1代接种DEF就在48h出现了明显CPE。适应DEF后的病毒，通常在36-48h就会产生CPE，随时间延长，CPE会更加明显，表现为细胞圆缩和脱落，细胞折光性增强，细胞变圆以及细胞融合，最终

8、崩解死亡。通过H.E.染色便可见细胞破碎，并有大量红染颗粒。通过RT-PCR检测，接种病毒的CEF为阴性，而接种DEF后检测为阳性（李玉峰等，2011）。3 鸭坦布苏病毒的研究现状1997年，温立斌等(温立斌，2001)从石家庄、邢台、邯郸等地发现康贝尔鸭产蛋下降，有神经症状，分离到有囊膜RNA病毒，经初步鉴定，疑似黄病毒，初步命名为“鸭病毒性脑炎”。曹贞贞等(曹贞贞，2010)于2010年将种鸭和蛋鸭发病死亡病例暂命名为“鸭出血性卵巢炎”。2011年，苏敬良、高福等(苏敬良等，2011)经过大量的研究工作，测序分析将其命名为白洋淀（BYD）病毒。李玉峰等(李玉峰，2011)发现，除种鸭外，商

9、品肉鸭也发病。黄欣梅等(黄欣梅，2011)报道鸭鹅均发病，将其命名为“脑炎-卵巢炎综合征”。 随后，傅光华等(傅光华等，2011；黄欣梅，2011)报道本病在蛋鸡、鸡群中发现。截至2011年12月15日，GenBank数据库收录了9株鸭源、1株鹅源、1株鸡源共11株DTMUV的基因序列。11株鸭坦布苏病毒的多聚蛋白、NS5、E基因核苷酸序列同源性均大于98%。其中BYD-1、JS804、FS、JM、muscovy/SD/China/2011、CJD05等6株病毒完成了全基因组或聚蛋白基因序列分析。E基因遗传进化分析发现，11株鸭坦布苏病毒分属于2个分支，其中CJD05、Fengxian、JS8

10、04、muscovy/SD/China/2011等4株的亲缘关系相近，与泰国蚊源株THCar同属一个分支；而BYD-1、FS、JM、duck/SD/CHN/2010等4株的亲缘关系相近，属于另一个分支。NS5基因遗传进化分析结果表明，11株DFV分属于2个分支，其中Huabei与其它10株亲缘关系较远，与Tembusu virus note N2 revived 14/6/82同属一个分支；而其它10株的亲缘关系相近，与泰国蚊源株THCar同属于一个分支。NS5和E基因进化分析结果提示我国的DFV源头可能来东南亚，而不同地区流行病毒株存在遗传变异情况(李玉峰，2012) 。4 流行特点鸭坦布苏

11、病毒在自然爆发时可感染除番鸭外的所有品种产蛋鸭，包括蛋鸭(如金定鸭、绍兴鸭、山麻鸭、缙云麻鸭、台湾白改鸭、康贝尔鸭)、肉种鸭(如北京鸭和樱桃谷鸭)及野鸭等(滕巧泱等，2010)。也有相关报道产蛋鸡(傅光华、陈仕龙等，2011）、鹅自然感染发病 (黄欣梅，2011)。在病毒的复制研究中，也有相关报道称人工肌肉注射或滴鼻接种分离的病毒在雏鸭、雏鸡、蛋鸭、雏鹅中成功复制出该病并回收到病毒(李玉峰等，2011；廖敏等，2011；曹贞贞，2010；Su Jing-liang and Hu Xu-dong，2011；黄欣梅，2011)。到目前为止，有相关领域的研究人员从泄殖腔棉拭子中分离到病毒，表明该病毒

12、可经粪便排毒；另一方面，相关领域的研究人员从鸭场内死亡麻雀体内检出鸭坦布苏病毒，提示病毒可经鸟类传播；带毒蚊子和麻雀可导致病原在不同鸭场间的传播。在病鸭组织样品中进行病毒分离，卵泡膜的检出率最高，达93%，近期该病毒在种鸭和种鹅上的垂直传播也有报道。5 诊断目前可用于鸭坦布苏病毒病原分离与鉴定的方法主要有SPF鸡胚和鸭胚病原分离法(Cao, Z et al., 2011)、常规RT-PCR检测方法(Yan, P et al., 2011)、一步法RT-PCR检测方法(张帅等, 2012)、套式PCR检测方法(颜丕熙等, 2011)、Real-time RT-PCR检测方法(Yan, L et

13、al., 2011)、一步法Real-time RT-PCR检测方法 (Yun, T et al., 2012)、RT-LAMP检测方法(Tang, Y et al., 2012)和间接ELISA法(姬希文等, 2011)等。5.1实验室诊断鉴于对鸭坦布苏病毒病的研究还不够深入，目前实验室用于检测鸭坦布苏病毒病的病原的方法不是很多，但是每一种都有自身的优缺点。常规的检测方法主要是血清学方法，包括中和试验、血凝试验、琼脂免疫扩散试验、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验以及分子生物学实验等。5.1.1血清中和试验(Virus-neutralization test, VN) 中和试验是目前最常用、最可

14、靠的方法，是公认的一种权威方法。通常在鸡胚上以固定血清-稀释病毒法进行，也有人在鸭胚、雏鸭或病毒适应细胞中进行试验。就目前而言，此病的中和试验的孵育温度、病毒量等的最佳条件的研究，还未见报道。利用中和抗体进行的空斑减少试验，微量中和试验也未见报道。中和试验虽是普遍认为的权威诊断方法，但其繁琐、费时、成本高，不能用于快速诊断，难以在基层中推广应用。在诊断其他鸭病上被认为是一种最可靠的方法，但用该方法诊断鸭坦布苏病毒病的研究还未见报道，相信在不久的时间内该方法的研究报道将接踵而来。5.1.2 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,

15、ELISA)是当前酶免疫测定技术中应用最广泛的技术，姬希文等(姬希文等，2011)首次建立了间接ELISA法以检测鸭坦布苏病毒（DTV）抗体，利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原，建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法，并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675g/孔，抗原最佳包被条件为37放置2 h后，4下过夜，血清的最佳稀释度为1200，酶标二抗的最佳作用时间为45min，酶标抗体最适稀释度为12000。在优化条件下，阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠

16、孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测，均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%，显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测，有108份样品呈现阳性，而琼扩试验只有32份呈阳性结果，而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品，证明该方法具有较高的敏感性和特异性。间接ELISA方法虽然具有灵敏度高，操作简便、特异性强的优点，很多学者也建立了用以诊断DTV的这种方法，但因所用的检测试剂（包被液、封闭液、酶标抗体等）尚未标准化，病毒的纯化和DTV阴性血清的制备等均存在一定难度，该方法在鸭坦

17、布苏病毒的检测诊断方面还未能得到广泛的应用(姬希文等，2011)。5.1.3分子生物学实验近两年来，随着分子生物学技术的飞速发展，专家学者对鸭坦布苏病毒的研究不断地深入，已经建立起检测鸭坦布苏病毒的分子生物学方法。曹贞贞、张存等在对不同地区的15份样品进行病毒分离后，RT-PCR检测结果显示禽流感、鸭瘟病毒、水禽细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭甲肝病毒、鸭形状病毒、鸭圆环病毒、鸭冠状病毒、鸡传染性支气管炎呈阴性，15份样品中，1份样品新城疫病毒阳性，为自然病例的混合感染现象；仅黄病毒RT-PCR检测呈阳性。这对于鸭坦布苏病毒的准确分类以及建立快捷的诊断方法奠定了基础（曹贞贞等，2010）。颜丕熙等根

18、据鸭坦布苏病毒E基因序列，设计了2对重叠引物，建立了检测鸭坦布苏病毒的套式RT-PCR方法，该套式RT-PCR比一般PCR敏感性高10倍，且具有良好的特异性。应用该套式RT-PCR对临床病料进行检测验证，结果表明该套式RT-PCR是检测鸭坦布苏病毒的有效手段，可用于鸭坦布苏病毒的临床诊断和分子流行病学调查。采用该方法对安徽省、河北省、山东省、浙江省、上海市等地发病鸭场的63份样品进行了检测，阳性检出率为48/63（76.2%），而病毒分离率仅为13/63（20.6%）。由此表明，与其他方法相比较，所建立的套式RT-PCR方法具有快速、敏感、特异优点，可用于鸭坦布苏病毒的流行病学调查及病毒的检测(颜丕熙，2011)。云涛等建立的一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法，利用MGB探针，在3非编码区设计一对引物和探针，最低能检出10 Copies/L的体外转录RNA量，在保证快速、准确、特异的基础上，大大提高了检测的敏感性，有利于，为鸭坦布苏病毒病的疫病监测和控制提供技术支持（云涛等，2012）。王友令等以新分离的病毒与其他亲缘关系较近的病毒为基础，根据6种E蛋白基因设计引物，