abi公司非常专业的定量pcr培训技术原理

1、定量PCRi：技术原理陈云地-407，chenyd2004年1内容提要v 基本概念v 定量PCR的数学原理v 定量PCR的化学原理v 硬件性能v 软件系统2定量的基本概念两种定量目标“ 600个拷贝”“ 增加10倍”4绝对定量相对定量标准曲线方法标准品未知样本5CT值对拷贝数的曲线浓度 = 4000 拷贝20,000 copies10,000 copiesCT = 24.85,000 copies2500 copies1250 copiesPCR的基本概念PCR原理链式反应的雪崩效应5'3'5'5'3'5'3'5'forward

2、primer5'3'5'3' 5'3'5'3'3'5'5' 5'reverse primer5'3'5'5'3'5'3'5'5'3'5'3' 5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'5'5'3'5

3、'3'5'5'3'3'5'8PCR 理论方程N = N0x (1+E)nN:N0:E： n:扩增子数量 起始模板数量扩增效率循环数9PCR动力学曲线10PCR分期平台期Plateau线性增长期LinearLog DNAy = x(1+e)n指数增长期Geometric循环数11定量PCR的基本概念两种定量方法“产生了6000000000个拷贝”终点定量线性图谱半对数图谱起点定量“加去600个拷贝”13两种定量方法对数期分析：平行性好14终点分析：没有严格规律两种定量方法同一个样品重复96次PCR实验15拐点产物数量：重现性好终点产物数量：

4、误差太大对数期定量的优势l 起始DNA量，更具意义l 重现性好，误差小l 扩增效率恒定，标准曲线呈线性16实时荧光PCR的基本概念实时荧光定量PCR18通过PCR来测定样品中的核酸数量通过荧光来检测PCR ，双倍放大模板可以是DNA或者RNA123456789101112log molecules用荧光检测PCR 产物SYBR Green I荧光标记扩增产物动态监测荧光信号变化荧光标记引物特异性荧光标记探针TaqMan探针、分子信标、杂交双探针荧光染料直接结合扩增产物SYBR Green I与DNA双链结合释放荧光信号TaqMan19荧光信号的产生荧光基团在激发光作用下，产生波长更长的发射光2

5、0“实时PCR” 指不开盖测定核酸闭管化学 (污染的风险低)没有PCR后处理 (无需走胶、拍照等)高度自动化定性：单数据点测定定量：多数据点测定能做基因分型及SNP鉴定lens21TaqMan®的技术优势PipetRead ResultsSamplesNo Gels!No Blots!22定量PCR的数学原理起点定量的关键：CT值CT值：荧光信号有统计学意义显著增长(穿过阈值线)时的循环次数线性图谱半对数图谱CT值CT值24为什么CT µ 起始DNA浓度?Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs总信号=本底信号+分子数量´单位信号强度Rn RB RS X0

6、E第n个循环时的总信号本底单位信号强度起始DNA数目PCR效率25为什么CT µ 起始DNA浓度?Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs当循环次数n=CT值时：RT = RB + X0 (1+ E)CT Rslg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) lg Rs+ log(RT - RB ) - log RSlog XOC= -Tlog(1 + Elog(1 + E)XX即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）26CT值 - X0 作图CT =

7、 - k logX0+ bX0CT手工操作方法：阈值决定CT值阈值CT阈值 = 基线信号的标准偏差 x 1028手工操作方法：基线决定阈值基线范围第3个循环-CT值前3个循环一般取3-15(进口试剂) 或6-15(国产试剂)-3个循环根据实验结果调整29阈值高度标准偏差基线范围手工操作标准步骤1.实验结束，软件根据默认值(3-15)自动分析数据给出初步CT值根据实验数据中 最小的CT值-3得出基线终点基线起点进口试剂取3，国产试剂取62.3.4.设定新起止点给出精确CT值重新分析数据5.正常情况下，两者相差不大。30自动操作方法软件自动计算全部参数：基线、阈值和CT值31定量PCR的化学原理两

8、种定量化学 染料染色 SYBR® Gre 溴乙锭(Eth 探针标记m Bromide) TaqManTM TaqMan MGB Dual-oligo FRET pairs 分子信标(Molecular beacons) ScorpionsTM/AmplifluorTM33RQ 一条探针，两条引物引物位于探针的两边 一条探针，两个基团前边是报告基团，后边是淬灭基团3'5'3'5'5'3'5'5'Ä 3'Hybridises with the target ampliconIs 3' termina

9、lly blocked (cannot be extended by the polymerase)Has two fluorescent dyes attached: 1. Reporter (R) 2. Quencher (Q)34TaqMan探针荧光共振能量转移(FRET)当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。Förster resonance energy transfer throu

10、gh space(Förster Ann. Phys. 1948)35TaqMan探针的FRETFluorescent Resonant Energy TransferTaqMan探针的FRETexternallight energyenergy transferR = reporterQ = quencher37反应过程：探针杂交Reporter dyeQuencher dye反应过程： Taq酶的53外切活性5 Nuclease Assay：39荧光5' nuclease assay(TaqManÒ chemistry)RQforward primerprobe

11、3'5'5'3'5'3' 5'Qreverse primer3'1. Polymerisation5'3' 5'3'5'5'2. Strand displacementRQ 3'5'3' 5'3'5'RQ5'3. Cleavage5'3'5'3'5'3'5'4. Polymerisation completedR = Reporter Q = Quencher40数量关系T

12、aqMan 探针上游引物RQ3553下游引物RQ35531.2.3.每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比41差别1个碱基的分辨力实验成功的关键： 不配对探针的稳定性 探针越长，不配对探针越稳定降低/消除非特异杂交显著提高实验重现性 HOW?Allele 2 (配对)FAMTAMRAAllele 1 (不配)FAMTAMRAMGB Probes42(non-fluorescent quencher) NFQQRAGGCCTTGAGAGATATMGB(minor groove binder)RAGGCCTTGAQAGATAT|G

13、CTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC43TaqMan MGB探针NFQQR5¢3¢MGBMinor Groove Binder (MGB Probe)Minor Groove Binder attached at 3' end of probe More potent than propynl substitutionsAll probes will be short (13-20-mers) 提高Tm(15 mer 提高 18°C) 探针更短 更多重的PCR 提高信噪比 无背景荧光 更好的淬灭效果Tm enhancerDTm

14、 or Mismatch ProbeStabilization(DTm = 6°C)(DTm = 17°C)TAMRAMGBTm=65Tm=65Tm=59Tm=4970°C65°C60°C55°C50°CDTm = Tm of perfectly matched probe - Tm of mismatched Discrimination of alleles is achieved by using an annealing/extension temperature within the DTm window45两种探

15、针效果比较ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGCTGTAAGTAGATATAACTAMRA probe 38-mer:MGB probe 17-mer:1.41.2MGB1.00.80.60.40.20.0051015202530354046Cycle NumberDR nTAMRATaqMan探针的其他衍生形式分子信标(Moleclar beacon)47杂交双探针变性退火延伸完成48探针法的优点灵敏而且特异PCR灵敏+ 探针杂交特异，优势结合测定起始浓度，非终产物浓度每循环采集数据，实时显示，实现CT值定量FAM ROXRn =49TaqMan ch

16、emistry的优点Noiseless data 特异性高due to the second level of specificity provided by the probeMultiplex compatible 多重基因定量each probe can be differently coloured and thereby mixed with othersSignal proportional to product荧光强度正比于产物signal related to amount of amplified product (not mass/length)不可逆反应 信号生成后不会自

17、动淬灭other probe chemistries use reversible hybridisation to generate signal50是一种DNA小沟结合染料与DNA结合时发光游离时不发光51SYBRÒ Green I在PCR过程中染料与DNA结合发光聚合开始聚合完成52SYBRÒ Green I数量关系1.2.3.每形成DNA双链，就有一定数量的染料结合上去染料一结合，就产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比53染料法的长处和短处成本低不需要探针最适合初步筛查先用SYBR筛查，需要时再用TaqMan精确定量熔解曲线功能确定PCR生成几种產物引物二聚

18、体无法多重检测只能检测单一模板无模板特异性只能给出总信号灵敏低难以准确测定低拷贝数的模板54熔解曲线(Dissociation curve)只有染料法才能做熔解曲线原始数据导数图谱55熔解曲线引物二聚体分析* 确认非特异性产物是否引物二聚体* 如果是引物二聚体: 优化引物浓度56多重定量多重荧光定量原理同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因使用不同的探针识别 探针标记不同的颜色。特点一次处理样品、一次反应同时给出多种基因或病原体定量检测结果不同扩增体系的信号相互无干扰58多重荧光定量59目标基因2目标基因1多色荧光技术u 荧光定量需要ROX校正和IPC校正u 检材和对照可以在同一管中定量u

19、仪器须有多荧光检测能力u 只有ABI，才有4-5色检测能力u FAMu VICu TAMRAu ROX目的基因第二个目的基因或者IPC 淬灭基团参比荧光60ABI Prism 荧光染料功能分类Reporter dye :6-FAM 、VIC、TET、NEDQuencher dye:TAMRA (常规TaqMan探针)Dark Quencher (MGB Probe)Reference dye:ROX- passive internal reference for signal normalisation- allows relative (not absolute) fluorescence

20、to be measured- critical for precision61多重荧光定量数据62VICNEDFAMCy5荧光PCR小结zzzzzzz几十个拷贝/单细胞的检测限：灵敏度高特异性强：探针杂交技术更快拿到结果：没有后处理，仪器自动分析不受污染干扰：闭管操作、dUTP-UNG酶防污染系统起点定量：实时扩增数据无须稀释样品：定量范围宽达9个数量级降低成本：一管多检 、校正误差63等位基因鉴定原理两条探针 正常与突变突变型(mut)SNP placed in the center of the probeQuencher; TAMRA or MGB/NFQ*65野生型(wt)终点结果实

21、时结果1/1纯合子1/2 杂合子66空白对照2/2纯合子定量PCR基本过程定量PCR实验基本流程1.2.3.4.5.6.准备模板(DNA或RNA)加试剂(模板+引物+PCR试剂） 填样品表（样品名、孔位）设置参数（探针、颜色、循环） 运行PCR数据分析68PCR热循环参数69UNG激活Taq 激活UNG灭活2-步PCR等位基因鉴定实验基本流程PCR试剂 + 引物探针 + 2 ng样品 Setup 42 x 384-well blocks every 1.5 hrsABI PRISM® 7900HT SDSwith integrated robotics>10,000 genot

22、ypes/hour70AnalyzeReadCycle(TaqMan Assay)ABI定量PCR仪大家族ABI荧光定量PCR仪大家族第一代：7700和57007700 ：4色5700：单色72ABI荧光定量PCR仪大家族第二代：7000和79007000 ：中小规模7900 ：高通量、自动化73ABI荧光定量PCR仪大家族第三代：7300和75007300 ：低价格、三重定量7500 ：5色检测、快速模式74共同的性能特点9个数量级1倍分辨率熔解曲线试验基因表达软件75仪器构造及性能7300 & 7500构造：门777300 & 7500构造：门New Door and Pl

23、ate LoadingManual Plate Loading Push Push Latch System 反应板机械卡牢Block Cleaning Position关开清洁787300 & 7500构造：灯 新型卤钨激发灯 额定寿命 2,000 小时 仪器监控灯的寿命，提醒换灯或评估寿命 更换方便，用户操作797000光路系统LampExcitationFold MirrorCCDCameraDFresnel LenstWellLensesFilter Wheel96-Well Plate80Multi- ElemenLensichroic MirrorFilter“real-t

24、ime PCR”lens capPCR vesselthermal blocksample81实时收集PCR数据PCR product accumulation is detected throughout the amplification process.0.40.350.30.250.20.150.1cycle 24cycle 25cycle 26cycle 27Cycle Number82Fluorescence (RN)7000：4色荧光Ø FAM/SYBR® Green IØ VIC/JOEØ TAMRAØ ROX报告荧光1/染料报

25、告荧光2淬灭荧光参比荧光7900：4色荧光Ø FAM/SYBR® Green IØ VIC/JOEØ NED/TAMRAØ ROX报告荧光1/染料报告荧光2报告/淬灭荧光参比荧光837300：4色荧光 FAM / SYBR® Green I VIC / JOE TAMRA / NED ROX (参比荧光passive reference)7500：5色荧光 5 片激发滤色片、5片发射滤色片 FAM, SYBR® Green I VIC, JOE NED, TAMRA, CY3 Dye ROX (passive referen

26、ce), Texas Red® CY5 Dye 增加荧光无须硬件变动：多重荧光解析算法软件847300 热循环 最新一代半导体技术 支持 测试最大反应体积 = 100 uL 测试最小反应体积 = 25 uL 96-孔标准光学反应板> 盖膜> 无需Compression Pad 0.2 mL 离心管> 8连管盖、单盖、平顶盖 固定升降温速率 +/- 1.1oC/sec Dissociation Curve Ramping857500 热循环 高速模式> 显著缩短实时定量PCR运行时间> 升级/降级需工程师安装 可控升降温速率 熔解曲线升温 标准9700模式

27、 仿真9600模式标准Thermal Cycler 支持测试最大体积 = 100 uL 测试最小体积 = 25 uL 96-孔标准光学反应板>>盖膜无需Compression Pad0.2 mL 离心管>>>8连管盖单盖平顶盖86仪器软件系统Software887300 & 7500 SystemsSequence Detection Software v1.2 Improved Usability 绝对定量Absolute Quantification(AQ)> Auto Threshold> Auto Baseline 相对定量Relati

28、ve Quantification (RQ)> RQ Plate> RQ Study containing max of 10 RQ Plates> Free for 7500 Customers Only 基因分型Allelic Discrimination (AD)> Autocall 阴阳性鉴定Plus/Minus with IPC (+/-)897300 & 7500Sequence Detection Software v1.2 Improved Usability Features>>>>反应板（样品表）设置向导鼠标指向扩增曲

29、线和AD图谱显示well ID 实时显示扩增曲线卤钨灯寿命监控90Sequence Detection Software v1.2 Plate Set Up Wizard -AQ91Sequence Detection Software v1.2 Plate Set Up Wizard - AQ92Sequence Detection Software v1.2 Thermal Profile93Sequence Detection Software v1.2 Software Results - Spectra View94Sequence Detection Software v1.2 Results - Amplification Plot95Sequence Detection Software v1.2 Results Standard Curve96Sequence Detection Sof