紫锥菊提取物对小鼠骨髓细胞微核影响试验研究

1、紫锥菊提取物对小鼠骨髓细胞微核影响试验研究科学方法分析报告报告人：高艳雄 于洋一 观察 紫锥菊提取物(Echinacea Herb P.E)由来自菊科植物紫锥菊(Echinacea Purpurea)的全草提取而得。本品为黄绿色粉末,味略涩,有天然的紫锥菊香气,溶于水和稀乙醇,主要成分为紫锥菊多酚(陆英等,2009)。目前紫锥菊提取物可以刺激免疫应答,增强免疫系统、预防流感、缩短伤风感冒患期,辅助治疗关节炎或皮肤病症,促进伤口愈合、缓解牙痛及烧烫伤疼痛,对抗细菌和病毒感染,癌症辅助治疗,受到国内外的极大关注(王长彦等,2008)。紫锥菊作为中国引进的天然“免疫”植物,因其具有突出的抗感染与免疫

2、促进作用,其提取物制剂在中国医学临床正得到越来越多的重视与应用。利用紫锥菊提取物作为动物保健品及饲料添加剂,不仅可以提高畜禽动物生产性能,还能保证畜产品卫生安全,对中国现代养殖业的健康快速发展具有重要意义。观察到紫锥菊提取物的这些特征，为探讨国产紫锥菊的毒性,开展了该提取物在小鼠体内的微核试验研究,目的是提供数据以阐明该紫锥菊提取物对健康小鼠骨髓内的微核率的影响,为进一步评价该药的毒性作用提供依据。二 提问紫锥菊提取物对人体有没有毒性作用？三 假设假设紫锥菊提取物进入人体后，会和人体的组织器官发生一系列的药物反应，从而对人体产生危害。四 推论如果假设成立，则紫锥菊提取物会对基因与人相似的小鼠产

3、生毒性，造成小鼠骨髓细胞产生微核。五 实验1材料与方法1.1受试物紫锥菊提取物由某制药厂提供,批号0901001,灌胃液以生理盐水配制。阳性诱变剂为环磷酰胺(CP, 40 mg/kg),分析纯,含量不低于98.5%,0.1 mL/只腹腔注射;阴性对照0.9%生理盐水(1 mL/只)灌胃。1.2试验动物ICR昆明科小白鼠,体重为(20±2) g,810周龄,雌雄各半。将动物编号,称重后输入计算机,根据动物随机分组的BASIC程序,按设定的组数随机分组。1.3试验器材载玻片、玻璃染色缸、定时钟、晾片架、显微镜(带油镜)、注射器及针头、干净纱布、乳头吸管、玻璃铅笔、解剖剪、镊子、止血钳、注

4、射器、灌胃针头、盖玻片(24 mm×50 mm)、塑料吸瓶、滤纸等。1.4试剂胎牛血清(灭活);姬姆萨(Giemsa)染液;甲醇(分析纯);1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)。1.5给药剂量由于各物质在体内代谢规律及引起骨髓细胞微核、染色体损伤的机理不同、剂量及反应规律也有差异。为减少假阳性,要用尽可能高的剂量,一般以1/2 LD50作为最大剂量。紫锥菊提取物的LD505000 mg/kg,故试验时以其最大浓度(5000 mg/kg)溶液,小鼠按1 mL/只口服给药作为最大剂量。1.6药液的配制各剂量组受试药物溶液可采用2倍递次稀释法配制。根据受试药物的小鼠LD50,按

5、小鼠1 mL/只受试药物给予体积要求,先确定1/2 LD50剂量组(即高剂量组)受试药物溶液需配制的浓度,再确定各剂量组所需受试药物溶液体积,以及将1/2 LD50剂量组受试药物溶液作为初始溶液需配制的体积,计算配制溶液时需称取受试药物的量。用天平或移液管称取受试药物置烧杯内,加入适量选定的溶剂溶解或稀释,转入容量瓶内,混匀并定容,即获得1/2 LD50剂量组(高剂量组)所需浓度的受试药物溶液。用量筒分取1/2体积的溶液供1/2 LD50剂量组给药,向原溶液中加入同体积的溶剂,混匀后溶液正好是1/4 LD50剂量组(中剂量组)所需的剂量浓度;用量筒分取1/2体积的溶液供1/4 LD50剂量组给

6、药,再加入同体积的溶剂,混匀后溶液正好是1/8 LD50剂量组(低剂量组)所需的剂量浓度,可供其给药(张萍等,2009)。1.7切片的制备取30只小鼠,雌、雄性各半,分别将雌、雄小鼠分为5组,每组雌、雄各6只。以紫锥菊提取物高浓度(5000 mg/kg)溶液,小鼠1 mL/只口服给药作为最大剂量,采用30 h两次给药法,即两次给药间隔24 h,第二次给药后6、12、24、48、72 h分别颈椎脱臼处死动物,打开胸腔,沿着胸骨柄与肋骨交界处剪断,剥掉附着其上的肌肉,取出胸骨,剪断胸骨体,暴露骨髓腔,用小号止血钳夹紧胸骨,挤出骨髓涂于事先加有2滴小牛血清的载玻片上,然后用推片法在载玻片上推成一薄膜

7、。凉干后在甲醇中固定10 min,凉干后用Giemsa应用液染色10 min,以常水冲洗干净,在油镜下选择细胞分散好、形态完整、染色良好的部位,按一定顺序进行计数(梁爱华等,2006)。1.8计数油镜下观察1000个嗜多染细胞(PCE)中微核(MN)出现的千分率。PCE在Giemsa染色下胞浆呈灰蓝色或淡紫色的无核红细胞,成熟红细胞(NCE)在Giemsa染色下胞浆呈淡桔黄色或桔红色的无核红细胞,求出PCE/NCE、MN/PCE(吴雨龙等,2008)。按下列公式计算雌、雄小鼠各试验组的PCE微核率和PCE/NCE值,同时计算各自的标准差:嗜多染红细胞微核率()=(试验组含微核PCE数/PCE检

8、查数)×1000PCE/NCE值=PCE检查数/NCE数试验结果用-X±SD表示。用SPSS 10.0统计软件对试验数据进行显著性比较。1.9正式试验小鼠50只,雌雄各半,按性别、体重将动物编号,根据动物随机分组原则分成5组,设3个给药组(高、中、低剂量组),阳性对照组、阴性照组。高剂量组以高浓度紫锥菊提取物溶液(1mL/只)口服(即2500 mg/kg),中、低剂量组按不同浓度,相同体积给予1250、625 mg/kg紫锥菊提取物溶液口服。阴性对照组选用0.9%生理盐水(1mL/只)口服。阳性对照选取环磷酰胺(40 mg/kg)0.1 mL/只腹腔注射;染毒后24 h按1

9、.7的方法处死动物、制备姬姆萨染色切片进行计数,按1.8的方法计数。试验所得数据如表所示：六 结论紫锥菊提取物染毒(5000 mg/kg)后不同采样时间点的小鼠骨髓细胞微核发生率见表1,对动物骨髓嗜多染红细胞微核发生率的结果见表1。由表1可知,以高浓度(5000 mg/kg)紫锥菊提取物溶液给小鼠口服后于6、12、24、48、72 h分别取骨髓细胞制片,计数MN/PCE,PCE/(PCE+NCE),可以看出小鼠染毒的各个时间后MN/PCE,PCE/(PCE+NCE)的值之间差异无统计学意义(P>0.05),故正式试验选用一次给药。由表2可知,紫锥菊提取物对小鼠骨髓细胞没有抑制及毒性作用(PCE/NCE1)。受试物组小鼠的微核率(MNF)与阴性对照组相比较差异