组织工程材料的表面改性研究及其在组织工程中的应用

1、组织工程材料的表面改性研究及其在组织工程中的应用陈宝林摘 要：本文从等离子体改性、接枝改性、聚合物表面基团的转变、生物活性分子的固定等方面论述了组织工程材料的表面改性方法及其在组织工程中的应用。关键词：组织工程；组织工程材料；表面改性；等离子体改性、接枝改性、聚合物表面基团的转变、生物活性分子的固定引言组织工程材料(Tissue Engineering Materials)的表面物理化学性质对材料的组织相容性(Tissue-compatibility)有着重要影响。因而对材料的表面进行改性(Modify)，在保持材料物理机械性能的前提下引入可促进细胞粘附和生长的基团或生物活性分子，可显著改善材

2、料的细胞相容性(Cell-compatibility)1-11。目前，细胞相容性聚合物(Cell-compatibility Polymer)的表面改性(Surfaces Modify)方法主要有：等离子体改性、接枝改性、表面基团的转变及表面生物活性分子的固定等方法。1、等离子体改性 作者简介：陈宝林（1960-），男，河北省人，汉族，1983年东北师范大学毕业，专业教授，主要从事组织工程材料（生物医用高分子材料）的制备及表征方面的研究。等离子体表面改性技术广泛应用于组织工程材料的表面改性。由于等离子体改性具有改性层被严格限制在材料表面（通常为几个纳米），对材料本体性能的影响很小，改性条件容易

3、改变和控制等优点而受到人们的青睐。低温等离子体中存在着电子、离子和游离基，它们所具有的能量比通常的化学反应所采用的能量要大，利用这些物理或化学作用可使高分子材料表面改性。此外，从等离子体发出的紫外线对高分子材料(Polymer Materials)的表面改性也起一定作用。目前较常用的是O2、N2、NH3等反应性气体、带有特定官能团的单体的等离子体。在这些等离子体的作用下，材料表面的化学结构或组成发生变化，生成对细胞的粘附和生长具有促进作用的基团。将聚氨酯(PU)管内壁用空气成分的等离子体处理后，表面含氧基团的增加使材料的亲水性(Hydophilicity)提高，导致纤维粘连蛋白(Fibrone

4、ctin,Fn)的强烈吸附(Adherence) 12。使内皮细胞(endothelial cell layer)层与管壁的结合变得牢固。利用二甲基甲酰胺、氨基化合物及氨气等离子体处理氟化乙丙共聚物(FEP)表面，在表面引入氨基、酰胺基等含氮基团，发现所有处理过的表面都支持细胞的粘附和生长，并且其中以酰胺单体处理过的表面情况最好13。Lee等14,15。用射频等离子体放电处理技术(Radio frequency plasma discharge treatment)将聚合物膜（片）持续暴露于等离子体中使表面发生氧化，改变处理时间，得到一系列不同的亲水性的表面。发现处理后的表面细胞的粘附和铺展得

5、到提高。等离子体改性也具有其自身无法克服的缺点，如等离子体可在表面溅射、刻蚀，使表面的形貌发生变化16；表面的化学结构不专一且易发生结构重组，不能很好的揭示特定的基团对细胞相容性的影响17。此外，等离子体改性表面随时间具有退化效应18。2、接枝改性在聚合物表面接枝带有对细胞的粘附和生长具有促进作用的功能基团是组织工程材料表面改性的另一方法。大量的研究集中于在材料表面接技亲水性单体，由于功能基团具有一定的亲水性，因而材料表面的亲水性得到改善，提高了其细胞相容性。组织工程材料的表面接枝可通过两种方法实现，即通过偶联的方法将一种聚合物接枝到另一种聚合物表面；将带功能基团的单体通过聚合反应接枝到聚合物

6、表面。2.1.偶联接枝偶联接枝是通过被接枝聚合物表面的反应性基团与接枝聚合物上的基团的反应而实现的。如Ikada等19将六甲基二异氰酸酯(HMDI)与乙烯-乙烯醇共聚物(EVA)反应在表面引入异氰酸根，通过异氰酸根与葡聚糖(Dextran)或胺基葡聚糖反应将其接枝到表面。Sefton20等将PEO末端的羟基氧化成醛基，接枝到末端带胺基的PMMA上，改善了PMMA的亲水性。结果表明，PMMA的细胞相容性得到提高。Fig.l Outline of preparation of PMMA-PEO-PMMA copolymer.2.2.接技聚合实现含功能基团的单体在聚合物表面的接枝聚合需要表面具有起引

7、发作用的活性种。因此，首先在材料表面引入起引发作用的活性种是实现表面接枝聚合的关键。目前，组织工程材料的表面接枝主要集中于探索表面活性种的引入方法。2.2.1.化学引发化学引发是通过试剂与聚合物的表面组分发生反应产生活性中心引发单体的聚合。如用过渡金属络合物和聚氨酯络合产生自由基引发单体的聚合21；将含偶氮基团的化合物与聚合物表面的羟基反应引入聚合物表面，通过偶氮基团的热分解引发聚合22。在过氧化物的存在下（如二苯过氧物(benzyol peroxide)），引发单体的聚合23。2.2.2.臭氧引发聚合物在臭氧的作用下表面被氧化，通过自由基加成反应可将单体接枝到聚合物表面。这是近些年发展起来的

8、改性新方法。臭氧引发的方法可应用于许多聚合物，加聚酰胺、聚酯、氟化树脂（如FEP）、聚氨酯及天然纤维（如羊毛和蚕丝）。可接枝的单体有丙烯酸、甲基丙烯酸及乙烯基吡咯烷酮等烯类单体24。臭氧引发的优点是表面过氧基团的含量易控，可通过臭氧的浓度和臭氧化时间来控制25；臭氧氧化及过氧基团的分解不会导致聚合物链的降解24。2.2.3.-射线辐射离子辐射，如-射线辐射可以在聚合物表面或本体层产生大量的自由基和离子化的活性种用以引发单体的聚合。-射线辐射接技可通过三种途径实现25-27：通过辐射产生的自由基引发单体的聚合，辐射和接枝同时进行；先对材料表面进行辐射处理使表面产生过氧基团，后通过过氧基团引发单体

9、接枝；对材料表面进行辐射处理，利用表面残留的自由基引发单体聚合。-射线辐射和接枝同时进行是制备水凝胶状材料常用的方法。Jansen等28采用“预溶胀技术”对PU表面进行了改性。先将PU管于单体（如HEMA）中浸泡，使单体渗透到材料的表面，-射线辐射下实现了接枝聚合。结果表明，材料的吸水率随接枝率的提高而增加。接枝层的厚度与浸泡时间有关，浸泡时间短，接技发生在表面；浸泡时间长，单体扩散到PU本体中，接枝层的厚度增加。-射线辐射在材料表面产生过氧基团，通过过氧基团的分解引发单体接技及对材料表面进行辐射处理，利用表面残留的自由基引发单体聚合时因表面活性种的数量较低，可降低表面接枝聚合物的含量及接枝物

10、的厚度29。接枝体系中需要加入起还原作用的盐如Fe2+以降低均聚物的量提高接枝率。虽然-射线辐射接枝的方法具有接枝速度快、易操作的优点，但由于其对材料的穿透能力强，穿透深度大，因而导致接枝不仅仅发生在表面，势必影响材料的本体性能。2.2.4.等离子体引发利用等离子体处理后材料表面产生的过氧基团引发单体的聚合可实现单体的接枝。.辉光放电(glow discharge)将等离子体处理后的材料取出暴露于空气中，通过表面自由基与空气中氧的反应在表面形成过氧基团，过氧基团分解后，可引发单体的聚合。研究发现，氩气、氧气和氢气等离子体处理的表面暴露于空气中后表面可生成过氧基团，而氮气等离子体处

11、理的表面则不能生成过氧基团。由于生成的过氧基团集中于材料的表面，因此接枝层仅局限于材料表面，且与接枝条件无关30。.电晕放电(corona discharge)电晕放电技术是一种新兴的等离子体处理技术。因其放电是在大气压下进行的，不同于常用的等离子体处理在真空下放电，因此具有简单易行的优点。处理后的表面含有过氧基团，因而可引发单体的聚合。Lee等31用电晕放电技术处理PE表面，将带羟基、羧基、酰胺基和氨基的单体接枝到表面。发现这些基团的存在改善了表面的亲水性，细胞的粘附率增加。2.2.5.光辐射引发光辐射引发自由基接枝聚合通常使用紫外光作为辐射源。利用紫外光辐射接枝具有操作简单、

12、成本低、处理的表面洁净等优点32。紫外光辐射接枝可分为光敏接枝（光敏剂存在下的接枝）和无光敏接枝（无光敏剂存在下的接枝）。对于生物材料的表面改性通常用无光敏接枝法。无光敏接枝是先通过紫外光辐照使材料表面氧化引入过氧基团，后用非均相溶液接枝方法将单体接枝到材料表面。空气中用紫外光氧化PP、PE、PEVA后发现，表面引入了过氧基团，其含量随辐照时间的增加而增加。表面接枝丙烯酰胺的量主要与表面的过氧基团的含量相关32。冯新德等33将聚氨酯置于过氧化氢水溶液中，紫外光辐照下实现了聚氨酯的氧化，丙烯酰胺接技后发现，表面的亲水性得到较大提高。3、聚合物表面基团的转变利用聚合物本体材料中已存在的基团的反应或

13、通过主链侧基上某些反应活性高的基团或原子的反应，可使聚合物表面产生小分子功能基团。主链饱和的聚烯烃材料，如PE、PP，主链较稳定。通过表面氧化可在表面引入功能基团。如用过硫酸盐氧化PP中空纤维膜，可在其表面引入羟基34。含有易被水解的酯基的聚合物如PMMA、PET可以在碱溶液中部分水解使表面产生羧基35，与二元胺如乙二胺反应在表面引入胺基36，与乙酐反应表面引入羟基37。含氟聚合物可用光化学方法改性。如PTFE可在紫外光作用下与碱或硫醇酯反应在表面引入羟基或磺酸基38,39。用1.3-丙磺内酯或1.3-丙醇内酯处理聚氨酯表面时，聚氨酯硬段氨基甲酸酯中的氮与内酯发生双分子亲核取代反应，表面生成磺

14、酸基或羧基。提高了聚氨酯的亲水性。通过控制表面磺酸基的含量或羧基可以提高材料的细胞相容性40,41。4、生物活性分子的固定材料表面引入生物活性分子可以促进细胞的粘附和生长，因此将生物活性分子固定到材料表面是提高其细胞相容性的重要方法。蛋白质作为重要的生物活性分子在材料表面的固定已有较多报道。蛋白质在聚合物表面的固定方法主要有物理吸附法、化学固定法。物理吸附是固定生物活性分子的一种最简便的方法。通过静电吸附作用可将含有多个负电荷的生物活性分子如肝素固定于材料中带正电荷的部位42；通过蛋白质与聚合物分子间的作用可将蛋白质吸附到聚合物表面43。吸附到表面的蛋白质用光辐射或交联剂可使其交联。将生物活性

15、分子中的某些基团与基质表面的反应性基团化学键合使其牢固地固定于材料表面是获得长期组织相容性的有效方法。这种方法克服了物理吸附中生物活性分子不能长期作用于材料表面、易脱离的缺点。这种固定方法通常要求基质表面具有-OH、-COOH、-NH2等反应性基团。因此通过表面改性使材料表面产生这些基团是固定的前提。对于生物活性分子的化学键合，研究者们更注重于材料的表面设计，即根据生物活性物质的特点设计可与其反应的表面基团。为了使细胞能有效识别表面固定的蛋白质，在化学固定过程中，必须考虑以下两点：空间位阻效应使蛋白质分子中的反应点与表面官能团的反应受到限制，蛋白质的固定量较小；由于材料表面物理结构的限制，蛋白

16、质中活性点被包埋，固定可引起蛋白质的变性，细胞受体与蛋白质之间不能建立最佳的相互作用。通过在聚合物表面预先引入“间隔基”(Spacer arm)有助于克服上述缺点44。蛋白质的化学固定通常分两步45：聚合物表面活化和活化表面与蛋白质的反应。4.1.蛋白质在含羟基聚合物表面的固定表面含羟基的聚合物可通过磺酰卤、碳化二亚胺、环氧树脂、二异氰酸酯、卤代烷等活化，活化可在有机溶剂如丙睛、二氯甲烷、丙酮、苯中进行46。表面的羟基被磺酰氯活化后生成反应性的磺酸酯，它可以进一步与蛋白质中的胺基或巯基反应生成C-N或C-S键从而将蛋白质固定（如(1)式）。Fig.2 Alcohols can be activ

17、ated with sulfonyl halides,which are readily displaced with amine ligands.羟基也可以被二酰亚胺活化，生成酰亚胺-N-甲酯（如(2)式），由于生成的酯中含离去基团，因此与蛋白质中的胺基反应生成氨酯键而将蛋白质固定47。Fig.3 Alcohols react readily with carbonyldiimidazole to produce reactive imidazole-N-carboxylates for coupling to amine-containing ligands.当双官能团的偶联剂如六次甲基二

18、异氰酸酯(HMDI)，与聚合物中的羟基反应时，羟基和偶联剂的一端反应，生成具有一定“臂”长的中间产物，偶联剂的另一端和蛋白质反应将其固定（如(3)式）48。Fig.4 Bifunctional coupling ageflts may be used, e.g., to coupling an amine-containing ligand to a hydroxyl-containing surface via a spacer.4.2.蛋白质在含羧基聚合物表面的固定蛋白质在含羧基的聚合物表面的固定必须先将羧基活化，常用的试剂为N-羟基丁二酰亚胺(N-hydroxysuccinimide)和

19、1-（二甲基胺丙基）-3-乙基碳化二亚胺。活化反应既可在水溶液中进行也可在有机溶剂中进行49。N-hydroxysuccinimide活化的表面与蛋白质的反应在水/有机溶剂体系中进行（如(4)式）。而1-乙基-3-(二甲基胺丙基)碳化二亚胺活化的表面与蛋白质的偶联在蛋白质的水溶液中进行50。Fig.5 Carboxylated surfaces can be activated to succimydil esters to subsequently couple amine-containing ligands.4.3.蛋白质在含胺基聚合物表面的固定Fig.6 Primary and sec

20、ondary amine-containing surfaces may be reacted with homo- or heterobifunctional bridges.表面含胺基的聚合物可为含双官能团的偶联剂反应而活化（如(5)式）51。所用的偶联剂有二异氰酸酯、二元醛、环氧树脂等。二异氰酸酯的活化反应通常在有机溶剂中进行，而与蛋白质的偶联在缓冲液中进行52。二元难如戊二醛由于与聚合物表面及蛋白质中的胺基反应速度较快通常被用于蛋白质在含胺基聚合物表面的固定。二元醛的活化反应及与蛋白质的偶联通常在水溶液中进行53。4.4.光固定光固定通常是在双官能团偶联剂存在下进行的。光固定蛋白质有三

21、条途径54-56：双官能团的化合物先固定到聚合物表面，后在光辐照下与蛋白质偶联；双官能团偶联剂首先在光辐照下固定到聚合物表面，后与蛋白质偶联；先将蛋白质偶联到双官能团的化合物上，再在光辐照下将其偶联到聚合物表面。所用的光活化剂有光敏性的偶氮、二苯甲酮和丙烯酸酯等。5、其他表面改性方法对组织工程材料的改性，除以上方法外，近年发展起来的离子注入和自组装单分子层生物表面等改性方法也受到人们的关注。将Si离子注入聚氨酯、聚丙烯、聚苯乙烯，材料表面的亲水性提高，对内皮细胞的粘附率有显著改善57。在硅橡胶表面引入功能基团，通过暴露于材料最表面的这些基团与生物介质发生作用在材料表面形成高度有序排列的单分子层

22、58，对研究生物体与高分子材料的相互作用及发展表面改性方法都具有重要的意义。6、结论与展望通过对组织工程材料的表面改性，在保持材料本身所具有的物理机械性能的同时赋予了材料表面组织相容性。材料的表面改性对组织工程的发展正起着越来越重要的作用。REFERENCES1Wang Dong-An(王东安),CHEN Bao-Lin(陈宝林),JI Jian(计剑),FENG Lin-Xian(封麟先),American Chemical Society(美国化学会主办),Bioconjugate Chem,2002,13(4):792-803.(SCI)2CHEN Bao-Lin(陈宝林),JI Jia

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