自制光化学衍生反应器测定食品中的黄曲霉毒素

1、自制光化学衍生反应器测定食品中的黄曲霉毒素B1范海东1 王玲锋2 赵冬吉2（1.海宁市计量检定测试所 2.海宁市产品质量监督检验所 314400）摘 要：黄曲霉毒素B1具有极强的毒性，是已知的强致癌物质之一。本文试通过黄曲霉毒素B1光化学原理，自制光化学衍生反应器，结合HPLC-FLD对食品中黄曲霉毒素B1进行检测，检出限可达到0.2ug/L。同时其制作成本远低于市售光化学衍生反应器。关健词：光化学衍生 黄曲霉毒素B1 高效液相色谱 DIY Photochemical Derivative Reactor for The Determination of Aflatoxin B1 in Foo

2、dsFANHAIDONG1 WANGLINGFENG2 ZHAODONGJI2（1. HaiNing Institute of Verification and Testing 2. HaiNing Product Quality Supervision and Testing Institute）Abstract: Aflatoxin B1 has a strong toxicity which is one of the strongest carcinogens in the world. This paper tries to aflatoxin B1 photochemical pr

3、inciple, derived from DIY photochemical reactor, combined with HPLC-FLD detection of aflatoxin B1 in foods, detection limits is 0.2ug/L.The production costs of the DIY is less than commercial photochemical derivatization reactor.Keywords: Photochemical Derivative Reactor Aflatoxin B1 HPLC0、引言 黄曲霉毒素具

4、有很强的毒性，是已知的强致癌物质之一。它是由黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，广泛存在于自然界中，它们是一类具有相似结构的二氢呋喃杂氧萘的衍生物。而黄曲霉毒素B1其毒性最强，具有极强的的毒性和强致癌性，我国在食品安全国家标准1中规定了各类食品中黄曲霉毒素B1的限量值。目前对食品中黄曲霉毒素B1的检测方法2 3 5有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、柱前衍生（I2）高效液相色谱荧光法、柱前衍生（TFA）高效液相色谱荧光法、柱后衍生（I2）高效液相色谱荧光法以及柱后衍生（光化学）高效液相色谱荧光法等几种方法。当采用高效液相色谱荧光法进行检测时，由于黄曲霉毒素B1在水溶液中会产生荧光淬灭现象，因此需要对其进行衍

5、生化，以增加其荧光强度，提高检测灵敏度。本文根据其原理3自制光化学衍生反应收稿日期：2012-5-31 修订日期 2013-05-06作者简介：范海东（1975），男，浙江海宁人，海宁市计量检定测试所 工程师器，结合高效液相色谱荧光法对黄曲霉毒素B1进行检测，并对自制光化学衍生反应器的线性和检出限、测量重复性、稳定性进行试验，试验结果良好，能满足正常使用要求且价格低廉。1、材料与方法1.1 原理光化学衍生反应器主要包括反应线圈、紫外灯、反应池架构成，根据食品中黄曲毒素检验法3，其基本原理是将一定长度的聚四氟乙烯管（内径为0.30mm）编织成长方形并固定于254nm紫外灯照射的不透光的反应池架中

6、，当带有黄曲霉毒素B1的流过反应线圈时，受到紫外光照射后被衍生成荧光性较强的黄曲霉毒素B2,从而提高了检测灵敏度。原理见下图1 图1 黄曲霉毒素B1紫外光照射原理图 Fig.1 aflatoxin B1 UV irradiation schematic1.2材料与仪器 Agilent 1200系列液相色谱仪及工作站（美国安捷伦公司），配自动进样器、在线脱气机、恒温柱温箱、荧光检测器）Pickering Vector PCX柱后衍生系统黄曲霉毒素B1标样 GBW(E)090015a 国家粮食局科学研究院黄曲霉毒素B1 标准工作液：10ng/mL，取黄曲霉毒素B1标样 GBW(E)090015a，

7、用甲醇多次稀释得到。在2-8下可保存3个月聚四氟乙烯管(PTFE)30S,21SUVC254nm紫外灯(PHILIPS TUV 8W)带灯架1/16PEEK手紧接头定制的反应池架市售一级大豆油去离子水甲醇和乙腈为色谱纯试验所用其他试剂均为分析纯1.3光化学衍生反应器的制作 1.3.1反应线圈的制作在分析3对荧光增强系统中所描述的反应线圈为25m长的聚四氟乙烯（PTFE）材质细管（1/16inch OD×0.25mm ID）,由于该规格尺寸无现成品出售，而在国内通用的聚四氟乙烯（PTFE）材质细管有以下规格（见表1）。型号内径（mm）外径（mm）（L）外径（mm）（T）外径（mm）（S

8、）300.30±0.100.60±0.100.70±0.100.80±0.10280.38±0.100.68±0.100.78±0.100.88±0.10260.46±0.100.76±0.100.86±0.100.96±0.10240.56±0.100.86±0.101.06±0.101.16±0.10230.66±0.100.96±0.101.16±0.101.26±0.10220.71

9、77;0.101.01±0.101.21±0.101.31±0.10210.81±0.101.11±0.101.31±0.101.41±0.10200.86±0.101.16±0.101.46±0.101.66±0.10表1 市售PTFE产品规格表Table 1. Commercially available PTFE Technical Data Sheet因此选择25m长规格为30S作为反应线圈(此反应器体积约为1.7ml)，采用通用的编织方式织成网格状的长方形（长15cm

10、5;宽5cm）（见图2），并在线圈二端分别套接一段规格为21S细管，这样可通过1/16PEEK手紧接头一端固定在液相色谱柱的出口端，一端连接荧光检测器。图2网格状的反应线圈Fig.2 Grid-like reaction coil1.3.2紫外灯及灯架 根据衍生所需254nm紫外光照射，在制作过程中选择了功率为8W的UVC紫外灯管（紫外线强度为28uw/c）并配以相应的灯架作为衍生反应光源，该紫外灯所产生的80-90%能量集中在253.7nm中心处,完全能够满足衍生反应照射强度要求。1.3.3 反应池架的制作根据需要和实际尺寸，设计了紫外灯架（38cm×3.5cm×2cm）

11、、反应线圈固定支 架（32cm×3.7cm×4.5cm）以及不透光外罩（39cm×4.5cm×4.5cm）三个部件（见图3），并在可能存在漏光的边角处用铝箔包裹防止紫外线外泄。图3 反应池架部件Fig.3 Reaction cell frame parts1.4 高效液相色谱条件按食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法2 标准中高效液相色谱法所规定的色谱条件进行检测。色谱柱：依利特Hypersil ODS2 C18柱（柱长150mm,内径4.6mm,填料直径5m）检测器：荧光检测器 nm， nm流动相：甲醇+水（45+55），

12、流速：0.8ml/min柱后衍生化系统：化学衍生系统：衍生溶液：0.05%碘溶液衍生溶液流速：0.2ml/min反应管温度：70反应时间：1min光化学衍生系统：自制光化学衍生反应器 照射反应时间：2min2、试验结果与讨论2.1线性范围及检出限 将黄曲霉毒素B1标准储备溶液用流动相逐步稀释成一系列浓度的标准溶液，浓度分别为：2ng/mL,4ng/mL,5ng/mL,10ng/mL, 20ng/mL,50ng/mL。进样50L,重复进样2次按仪器条件测定，得到标准色谱峰，并以峰面积作标准曲线。可得到黄曲霉毒素B1标样浓度与其峰面积成线性关系，其标准曲线图（见图4）。同时又根据S/N>3可

13、得到黄曲霉毒素B1的检出限为0.2ng/mL（见图5）。同时发现液相色谱柱型号对出峰时间和峰形影响较大，采用ODS2的C18柱能保持较好的峰形和较早出峰。图4黄曲霉毒素B1标准曲线图Fig.4 standard graph of Aflatoxin B1图5黄曲霉毒素B1标准色谱图Fig.5 standard chromatogram of Aflatoxin B12.2测量重复性及稳定性 由于光化学衍生过程中所使用的紫外灯的辐照强度会直接影响最终检测的荧光强度，因此必须对其衍生反应器的测量重复性和稳定性进行试验。在对紫外灯管老练100h后，在打开光化学衍生反应器的条件下，对浓度为5ng/mL

14、黄曲霉毒素B1标准溶液进行连续6次测定，测得的重复性RSD%为0.83%（见表2）；同时每周一次对浓度为5ng/mL黄曲霉毒素B1标准溶液进行6次测定，连续测定4周对其短期稳定性进行试验，根据第1周的峰面积平均值与第4周的峰面积平均值相比较其变化率不超过1%。紫外灯辐照强度随着使用时间逐渐衰减，在对首次使用时测得的峰面积与点燃300小时后测得的峰面积相比较无显著变化；同时依据紫外线杀菌灯4中规定紫外灯管的平均寿命不低于5000h，在正常燃点2000h和70%额定寿命时，253.7nm紫外线辐射通量维持率应不低于85%和70%。在综合考虑实际使用频率，建议紫外灯管的使用寿命不超过1000h。 表

15、2测量重复性Table 2. repeatability of measurement2.3柱后衍生系统的比较 将浓度为10ng/mL黄曲霉毒素B1标样分别采用柱后碘衍生反应和柱后光化学衍生反应进行试验，并比较其响应值（见图6），由图可得柱后光化学衍生黄曲霉毒素B1的响应值约为柱后碘衍生反应的响应值的75%左右，检测结果基本一致。同时对两种方法原理、设备成本、操作方法、响应值及最低检出限进行了比较（见表3）。图6-1柱后光化学衍生Fig.6-1 Post-column Photochemical Derivatization 图6-2柱后碘衍生反应Fig.6-2 Post-column iod

16、ine derivative reaction比较 内容柱后碘衍生反应柱后光化学衍生原理需配备柱后衍生泵用于碘液注入衍生需使用光化学衍生反应器照射衍生设备 成本衍生系统售价约10-15万元市售光化学衍生系统售价约3-4万元自制光化学衍生系统成本约1000元操作 方法分析前需配制新鲜碘液，分析后需清洗管路防止腐蚀堵塞，较费时费力且会影响荧光检测器使用寿命不需要不需要响应值及最低检出限相对光化学衍生响应值较高，最低检出限为0.2ug/L文献5 给出最低检出限<0.5ug/L响应值约为柱后碘衍生反应75%，最低检出限为0.2ug/L 表3 柱后衍生系统的比较图Table 3. Post-col

17、umn derivatization system chart2.4 食品检测中的应用 按食品中黄曲霉毒素的测定2对大豆油进行样品预处理，通过光化学柱后衍生系统和高效液相色谱对样品进行检测，取市售大豆油样品作本底进行3个水平的加标回收率试验（见图7），回收率在82%-85%之间（见表4）。图7-1 大豆油样品Fig. 7-1 Soybean oil samples图7-2大豆油样品加标回收试验Fig. 7-2 Soybean oil spiked recovery test样品加标量ng/mL平均回收量ng/mL平均回收率%大豆油10.8282.0108.4084.05042.585.0表4回收试验结果（n=6）Table 4. Result of recovery test2.5讨论 通过对自制柱后光化学衍生反应器的线性范围及检出限、测量重复性及稳定性进行的实验，并对两种柱后衍生系统进行了比较。经过实验证明自制柱后光化学衍生反应器完全能满足检测需要，与柱后碘衍