玉米延迟性低温伤害综合试验

1、玉米延迟性低温伤害综合试验【摘要】 为了研究低温对玉米的伤害，以常温下培育的玉米作对照，对低温植株叶绿素含量、植物组织水势、植物根系活力、植物组织抗逆性及过氧化物酶活性等指标进行了测定。实验中主要应用了分光光度计，数据处理中，以科学数据库作对照的方法进行验证的。结果表明植物的代谢能力加强，但是储存机制变弱，植物细胞的活力也受到了很大的影响，根的吸收及活力都会收到影响。【关键词】 玉米 低温 叶绿素含量 根系活力 过氧化物酶活性 组织水势 温度是植物的生长发育中的一个重要影响因子。低温是一种逆境条件，尤其是在寒冷的北方，植物体会受到伤害，严重时甚至会导致植株死亡。持续低温，植物体会发生一系列生理

2、变化。因此，提高植物的抗寒性对农业具有十分重要的意义。玉米的低温冷害在世界上许多国家均有发生, 并采取了积极的措施，如推迟播种期、保暖育苗、选择常年无霜地带的田块种植冬早玉米、覆膜栽培等。目前研究表明玉米种胚和幼苗内多胺调控与耐寒性的关系低温冷害影响玉米种子发芽、出苗和幼苗生长，最终降低玉米产量，但还是有待我们进行进一步证明。1材料与方法1.1 材料: 久龙玉米种子 、九单玉米种子分别取大小相同、形态相近的种子各100粒在沙基培养基中用完全培养液在光照充足、温度适宜的环境中培养至幼苗期进行实验1.2 方法 挑选四份生长状况一样的植株，分别放在4的温度下培养24h、 12h、6h和正常温度下进行

3、培养，然后将苗取出，进行实验，分别对正常组与实验组进行实验，最后将实验进行对比，具体实验步骤如下。1.2.1叶绿素含量的测定取常温叶片0.1g两份，放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及95%乙醇23ml，充分研磨成匀浆。再加95%乙醇10 ml继续研磨至发白。取滤纸用乙醇润湿后过滤。将过滤后溶液用95%乙醇定容至25mL，摇匀，得到叶绿素提取液。把叶绿素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，分别在波长665nm,649nm下测定吸光度。记录数据。取处理后叶片按照上述方法再做一次。1.2.2电导法测定植物组织抗逆性取常温叶片0.5g，用蒸馏水洗净后切成小片，放入注射器内，吸取10

4、mL蒸馏水，进行抽气，直至叶片沉入蒸馏水中为止。将叶片及溶液倒入小烧杯中，测定其电导值。然后用微波炉将其煮沸，冷却至室温后，测定其终电导值。同时测定水的电导值。取处理后叶片按照上述方法再做一次。1.2.3根系活力的测定称取常温根系样品0.5g，放入烧杯中，加入TTC溶液和磷酸缓冲液各5mL。把根充分浸染在溶液中，在37下暗保温1h。此后加入2mL H2SO4（1mol/L）终止反应。做一对照组，先加2mL H2SO4（1mol/L），再加根系样品0.5g，加入TTC溶液和磷酸缓冲液各5mL，在37下暗保温1h。将根取出，吸干后与3mL乙酸乙酯一起在研钵中研磨，以提出甲腙。将红色的提取液移入试管

5、，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤3次，将洗液也移入试管。最后使总量为10mL。用分光光度法在波长480nm下以乙酸乙酯为空白，测吸光度。然后对照TTC标准曲线。取处理后叶片按照上述方法再做一次。1.2.4植物组织水势的测定配制一定量的1mol/L蔗糖母液。再按下表配制各梯度浓度溶液。溶液/molL-10.050.10.20.30.40.5加入母液/mL0.512345加蒸馏水/mL9.598765用打孔器取玉米叶片10片，分别去六份，装入6各个带塞的青霉素小瓶中。在各小瓶中加3mL上述梯度浓度溶液。静置40min。每5min摇一次小瓶。用阿贝折射仪分别测出各梯度浓度溶液和小瓶中静置后的溶液的折光率

6、。对比前后折光率。取处理后叶片按照上述方法再做一次。1.2.5过氧化氢酶活性测定取常温叶片0.5g，加入5m磷酸缓冲溶液，研磨成匀浆。转移至离心管中，在000r/min下离心10min。取上清液用磷酸缓冲溶液定容至10mL。分成两组。如下操作：对照PBS/mL2.82.82.8愈创木酚/mL111过氧化氢酶液/mL0.2(煮)0.20.237保温15min,冷却三氯乙酸/mL先加入222以第二支试管中溶液为空白，对第一只试管在波长240nm下进行比色，记录数据。取处理后叶片按照上述方法再做一次。2结果2.1叶绿素含量的测定结果分光光度法665nm和649nm下测定吸光度，每组测两次取平均值，记

7、为649L ,665L ,649D,665D,结果见下表。表格 1 叶绿素含量测定(4)吸光度649nm665nm条件24h12h6h常温24h12h6h常温10.8071.3000.7920.2631.5341.9511.5211.87620.8151.3030.7840.2571.5511.9531.5111.89730.8071.2960.7890.2621.5471.9481.5221.860平均值0.8091.3000.7880.2611.5441.9511.5181.878表格 2九单素含量测定(4)吸光度649nm665nm条件24h12h6h常温24h12h6h常温11.106

8、1.6041.1270.1231.8762.3981.9240.20621.1261.6091.0870.1171.8972.3981.8890.19731.0921.6071.1080.1221.8602.4021.910.203平均值1.1081.6071.1070.1211.8782.3991.9080.202将得到的光度值带入如下公示：A=pv/1000m, 得正常叶子的叶绿素含量九单1.3875mg/g，而处理后的叶子的叶绿素含量：6h 1. 3803mg/g 12h 1.3547mg/g 24h 1.3285mg/g。久龙2.0536mg/g，而处理后的叶子的叶绿素含量：6h 2.

9、 0498mg/g 12h 2.0112mg/g 24h 1.9987mg/g。 2.2电导法测定植物组织抗逆性的测定结果叶片的煮沸前电导值记为S1，煮沸后的电导值记为S2，蒸馏水水的电导值记为S0，结果见下表。S0=7.54 -1表格 3 电导的测定品种处理12h6h常温久龙未煮沸8.05.27.5煮沸117.68.5九单未煮沸6.94.58.3煮沸7.58.5510.9 根据伤害度的计算方法：6h 伤害度%=（L1-Lck）*（1-Lck）-1*100,得伤害度%=13.49%。 12h 伤害度%=（L1-Lck）*（1-Lck）-1*100,得伤害度%=37.78%。 24h伤害度%=（

10、L1-Lck）*（1-Lck）-1*100,得伤害度%=42.59%。2.3根系活力的测定结果2.3根系活力的测定结果TTC法测九龙根系活力数值分光光度法480nm下测定吸光度，每组测两次取平均值，记为A480，结果见下表。TTC法测九龙根系活力的TTC还原量 TTC法测久龙活力的TTC还原量温度常温6h12h24h久龙8.914.623.32.06温度常温6h12h24h久龙 0.026 0.018 0.011 0.0060.029 0.013 0.009 0.0090.027 0.011 0.012 0.009平均值 0.027 0.014 0.011 0.008TTC法测久单根系活力数值

11、 温度常温6h12h24h九单 0.062 0.021 0.018 0.0110.060 0.024 0.016 0.0130.061 0.021 0.017 0.013平均值 0.061 0.022 0.017 0.012 TTC法测久单根系活力的TTC还原量 温度常温6h12h24h九单20.137.265.613.322.4植物组织水势的测定结果久龙浓度0.050.10.20.30.40.5蔗糖1.33551.33901.34501.35001.35551.3605常温组1.33751.337601.33981.34451.34851.35406h12h24h1.33251.33121.

12、32901.33561.33341.33301.33951.33731.33781.34671.34751.34091.34861.33971.33561.35141.33361.3314九单浓度0.050.10.20.30.40.5蔗糖1.33551.33901.34501.35001.35551.3605常温组1.34051.34201.34551.34801.35101.35606h12h24h1.33951.33221.33101.33851.33341.33111.34551.33331.33201.34601.33351.33201.34951.33371.33261.35201.

13、33391.3336久龙： 6h在第三组发生失水水第四组发生吸水，12h在第三组发生失水第四组发生吸水，24h在第四组发生失水第五组发生吸水。九单：6h在第三组时发生等渗现象，12h，24h均没有发生失水或吸水现象。2.5过氧化氢酶活性测定结果分光光度法470nm下测定吸光度，每组测两次取平均值，记为A470，结果见下表。久龙水势测定 吸光度实验组对照组时长24h12h6h常温24h12h6h常温10.0270.0350.0560.060.0120.0220.0580.06420.0390.0410.0510.0590.0140.0240.0610.05930.0310.0330.0590.0

14、720.0120.0230.0620.069平均值0.0320.0360.0550.0640.0130.0230.060.064 九单水势测定 吸光度实验组对照组时长24h12h6h常温24h12h6h常温10.0180.0370.0980.1230.0220.0370.1010.10620.0130.0340.1120.1170.0240.0330.1130.12130.0120.0380.1080.1220.0230.0340.0970.087平均值0.0140.0360.1060.12100230.0350.1040105根据公示：过氧化物酶活性U/(g·min)= 反应时间内

15、吸光度的变化*提取酶液总体积 叶子的质量*测定时取用酶液体积*0.01*反应时间得九单常温过氧化物酶活性 = 294.7U/(g·min) 6h过氧化物酶活性 =113 U/(g·min) 12h过氧化物酶活性 = 67 U/(g·min) 24h过氧化物酶活性 = 34U/(g·min)久龙常温过氧化物酶活性 =228 U/(g·min) 6h过氧化物酶活性 =198 U/(g·min) 12h过氧化物酶活性 =71.5 U/(g·min) 24h过氧化物酶活性 = 49.4U/(g·min)3结论31叶绿素含量

16、的测定叶绿素的生物合成是一系列酶促反应，受温度影响很大。最适温度是20一30。温度过高或过低均降低光合速率，加速叶绿素降解。32电导法测定植物组织抗逆性 生物细胞,通过细胞膜这种结构与生物体内细胞、细胞器及环境界面起着物质交换的作用,同时保持生物细胞正常生理生化过程的稳定性。当外界环境条件发生变化时 ,首先影响生物膜的物理化学性质的改变。如植物组织受到逆境伤害时，由于膜的功能受损或结构破环，而使其透性增大，细胞内的盐类或有机物有不同程度渗出，从而影响植物的生理过程，但是具体的影响方法是什么，还需要进一步的研究。3.3 根系活力的测定植物低温伤害的主要原因是冷诱导的细胞质酸化, 可能与液泡膜质子

17、转运系统的破坏密切相关。在我们的研究中,简令成31指出, 冷害首先是损伤细胞的膜结构,然后引起生理生化过程的破坏。钙可能作为磷脂的磷酸根和蛋白质的羧基间联结的桥梁, 使膜结构更为牢固, 从而提高根系活力, 也可能与细胞中的果胶酸形成果胶酸钙, 保护中胶层结构, 降低细胞壁的降解。钙的另一重要作用是通过钙-钙调素信号转导系统诱导抗逆基因的表达, 提高抗氧化酶活性32 , 诱导渗透调节物质的合成33 , 增加细胞中煮沸稳定蛋白质的含量, 从而增强植物细胞忍耐低温的能力, 其机理尚需进一步研究。3.4植物组织水势的测定生物膜是细胞、细胞器与环境间的界面，既能接受、传递环境信息，也能对环境胁迫作出反应

18、，同时对维持正常生理生化代谢尤为重要71。叶片细胞膜透性的变化可以反映逆境对细胞膜的伤害程度。当植物受到逆境影响时，如在不适宜的低温胁迫下，植物细胞膜会遭到破坏，膜透性增大，且细胞膜相对透性的大小与植物细胞膜受伤害的程度成正相关。质膜ATP酶是冷害损伤的初始部位,质膜上包括ATP酶在内的各功能蛋白质受到破坏,丧失功能,从而导致了细胞膜结构损伤,进而影响到细胞的生理生化代谢而对植物产生危害。3.5过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系。过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，

19、可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。在低温的情况下，植物机体会感受到外部环境的变化从而引起了过氧化氢酶活性明显的增加，维持体内环境的正常运行。4 讨论从这五个植物指标的测量中，对植物在低温胁迫下的生理状况进行了完全而又细致的分析与证明，从这几个指标的分析叶绿素含量的测定与酶活力的测定是对植物在低温胁迫下呼吸方面的能量代谢进行检测，而电导率与水势的测定则是对植物细胞渗透的相关鉴定，从实验数据看出在低温胁迫下，叶绿素含量有了明显的降低，而呼吸代谢有了明显的提升，说明了在逆境下植物会感受到外界环境的变化，引起植物自身的变化

20、，加强呼吸维持自身能量的需求，但是在这种情况下，能量的储存却明显的下降，却提出了一个疑问，这种消耗大于产能的形式最终导致了植物在持续逆境环境下的死亡，这个结论还是需要继续进行实验对其进行验证。能量代谢的直接场所是细胞，细胞的渗透直接影响了细胞的物质交换与信息的传递，在电导实验中，在低温逆境下，在我们的7 个小时的过程中，植物的细胞膜结构受到了一些损坏，也许长时间可以让植物的细胞膜彻底的损坏，由于膜结构的小部分受损，细胞内盐物质或有机物不同程度的渗出，这样就使得植物的渗透压下降，使得植物细胞的被动运输与主动运输能力下降，这一点可以从植物水势的测定结果中清楚的看出。而且根的活力也有所下降，对于根的呼吸以及渗透作用都有所影响，所以说低温对于植物来说影响的是方方面面的。所以，植物在低温环境下，外部的表现是储藏物质的消耗，内部的表现是植物细胞活动的下降，基于这两点，我们应该对植物的低温胁迫进行更加深入的研究，从植物的细胞入手，看看是什么限制了细胞的活力，或者