酶工程最终版

1、酶工程最终版第一章 绪论1. 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。 酶工程的主要内容包括：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶 的提取与别离纯化，酶分子 修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反响器和酶的应用等。 酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶的催化特 性得以改良，充分发 挥其催化功能。2. 酶有哪些显著的催化特性？ 酶是生物催化剂， 与非酶催化剂相比， 具有专一性强、 催化效率高和作用条件温和等显著特点。3. 简述影响酶催化作用的主要因素。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温

2、度、 pH 、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。5. 简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。酶活力单位：在特定条件下温度可采用 25 C, pH 等条件均采用最适条件，每 1min 催化 1 卩 mol 的 底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位IU 。在特定条件下，每秒催化1mol 底物转化为产物的酶量定义为 1 卡特 kat酶活力的测定方法： 振荡测定法， 酶柱测定法， 连续测定法， 固定化酶的比活力测定， 酶结合效率与 酶活力回收率的测定， 相对酶活力的测定。或者测定方法：化学测定法、光学测定法、气体测定法其它.酶的开展历史： 4000 多年前的夏禹时代酿

3、酒技术。 3000 多年前的周朝制造饴糖、食酱等食 品。 1833 年 佩恩和帕索兹从麦芽的水抽提物中得到淀粉酶。19 世纪中叶巴斯德对酵母的乙醇发酵进行研究。 1913 年米彻利斯和曼吞根据中间产物学说，推导出米氏方程。1926 年萨姆纳得到脲酶结晶，并证明它具有蛋白质的性质。 1960 年雅各和莫诺德提出操纵子学说。 1982 年切克发 现核酸类酶。 1983年一一阿尔特曼发现核糖核酸酶P 的 RNA 局部 M1RNA 具有核糖核酸酶 P 的催化活性。酶的专一性分为绝对专一性和相对专一性。相对专一性又可分为键专一性和基团专一性米氏方程：酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反

4、竞争性抑制。Km 增大不变减小Vm 不变减小减小酶的生产方法：提取别离法，生物合成法，化学合成法第二章经过预先设计，通过人工操作 ，利用微生物的生命活动获得所需要的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。 酶的发酵生产是当今 产酶的主要方法，因为微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点。1. 试述酶生物合成的根本过程。a.RNA 的生物合成一一转录：转录的起始、 RNA 链的延伸、转录的终止、RNA 前体加工成为成熟的RNA 分子。b. 蛋白质的生物合成 翻译：氨基酸活化生成氨酰-tRNA 、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合 成的终止、蛋白质前体加工修饰成具有特定空间结构的功能蛋白。2.

5、何谓酶生物合成的诱导作用？是简述其原理。参加某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。 原理：当无诱导物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因结合，覆盖RNA 聚合酶的结合部位，RNA 聚合酶无法与启动基因结合，结构基因无法转录，酶合成受受阻。当诱导物存在时，其与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变而降低与操纵基因的结合能力，RNA 聚合酶与启动基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以表达。3. 什么是酶生物合成的反响阻遏作用？试简述其原理。酶工程最终版 酶生物合成反响阻遏作用指酶催化反响的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏。 原理：无阻遏物存在时，调节

6、基因产物阻遏蛋白无法与操纵基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以正常表达。当阻遏抑制 RNA 聚合酶与启动基因的结合，物存在时，其与阻遏蛋白结合使之空间构象发生改变，阻遏蛋白与操纵基因结合， 下游结构基因转录受阻，酶无法正常表达。4. 简述分解代谢的阻遏作用的原理及解除方法。 分解代谢阻遏之所产生，是因为细胞内某些物质经分解代谢产生ATP, ATP 贝 U 是由 ADP 和 AMP 经磷酸化转变而来， ATP 合成，即意味着胞内 ADP 、AMP 浓度下降， cAMP 通过水解作用以补充胞内 AMP 浓 度, 故胞内 cAMP 浓度下降。同时腺苷酸环化酶活性降低 , cAMP 合成受阻, 致使

7、胞内 cAMP 浓度进一步降低。故而 cAMP-CAP 复合物浓度随之降低，启动基因特定部位无足够 cAMP-CAP 复合物与之结合从 而抑制了 RNA 聚合酶与启动基因的结合 ,结构基因无法表达 , 酶合成受阻。解除方法：在培养环境中控制某种易降解物质的量 ,或在必要时添加适量的cAMP 。5. 酶的生物合成有哪几种模式？ 同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。6、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件？a ?保藏的菌种用于生产之前要通过细胞活化使细胞的生命活力得以恢复；b?艮据不同细胞和不同用途的不同要求配置各营养组分适宜的培养基；c.根据不同菌种、不同产物、不同工艺条件等不同情况调节

8、培养基 pH 、温度、溶解氧量使之处于适宜状态。7提高酶产量的措施主要有哪些？ 添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加外表活性剂、添加产酶促进剂。10. 简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点？ 提高产酶；可以反复使用或连续使用较长时间；基因工程菌的质粒稳定、不易丢 失；发酵稳定性好； 缩短发酵周期 , 提高设备利用率；产品容易别离纯化；适于胞外酶等胞外产物的生产。11. 固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点？ 变胞内产物为胞外产物；提高产酶率；稳定性较好；易于别离纯化。第三章 动植物细胞培养产酶2, 何为抗体酶？试述获得抗体酶的主要方法。 答：抗体酶又称为催化性抗体 , 是一类具有生物催化功能的抗体分

9、子。1半抗原诱导法。 以预先设计的过渡态类似物作为半抗原 , 与载体蛋白如牛血清蛋白偶联制成抗原 , 然后免疫动 物, 再经过单克隆抗体制备技术制备 ,别离, 筛选得到所需的抗体酶。2酶蛋白诱导法。 是以某种酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。 首先选定一种酶蛋白作为抗原来免疫某种动物 , 在酶 蛋白抗原的诱导下 , 动物体内产生与酶分子特 异结合的抗体；再将获得的酶抗体来免疫该动物 , 并采用单克隆抗体制备技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。 那么抗抗体结合部位 的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同。对抗抗体进行筛选 , 就有 可能获得具有催化活性的抗体酶。3, 植物细胞培养产酶有

10、何特点？ 答： 1产率高。2生产周期与完整植株相比拟短 , 一般为1530 天。3易于管理, 减轻劳动强度。4提高产品质量。5其他：对剪切力敏感 ,生产周期长 ,许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照5, 试述植物细胞产酶的工艺条件及其控制。答： 1温度的控制。一般为 25 度左右。通常不高于 35 度, 不低于 20 度。酶工程最终版2PH 的控制。一般为 PH5.55.8 o 通常介于 5.06.0 的微酸性范围。3溶解氧的调节控制。一般通过通风和搅拌来供应。不能太强烈，以免破坏细胞。4光照的控制。根据植物细胞的特性及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调控。5前体的添加。为提高次级代谢物

11、产量在培养过程中添加目的代谢物的前体。6 刺激剂的应用。促使植物细胞的物质代谢朝着生成某些次级代谢物的方向进行，强化次级代谢物的生物合成，提高某 些次级代谢物的产率。6，动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件？答： 1温度。一般在 36.5 度，允许波动范围在 0.25 度之内2 PH 。一般在 PH7.4 条件下生长最好，通常在 7.07.6 的微碱性范围内。3 渗透压。一般在 700850kPa 范围内。4 溶解氧。一般通过调节进入反响器的混合气体的量及其比例调控溶解氧。混合气体由 空气，氧气，氮气，二氧化碳四种气体组成。二氧化碳兼有调节供氧和调节 PH 的双重 作用。7, 举例说明动物

12、细胞产酶的工艺过程。 答：以生产组织纤溶酶原活化剂为例：1 配制人黑色素瘤细胞培养基。2人黑色素瘤细胞培养：A 将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用 PH4.7 的磷酸缓冲 液洗涤,计数, 稀释成细胞悬浮液；B 在消毒好的反响器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反响器中，接种浓度为10003000个细胞/ml，于37度的C02培养箱中，通入含5%CO2的无菌 空气，培养至长成单层致密细 胞；C 倾去培养液，用 PH7.4 的磷酸缓冲液洗涤细胞 23 次；D 换入一定量的无血清 Eagle 培养液，继续培养；E 每隔 34 天，取出培养液进行 tPA 组织纤溶酶原活

13、化剂的别离纯化；F 再向反响器中参加新鲜的无血清Eagle 培养液，继续培养，以获得大量tPA 。3组织纤溶酶原活化剂的别离纯化。 在获得的上述培养液中参加一定量的蛋白酶抑制剂和外表活性剂 ,过滤去沉淀,适当 稀 释后，采用亲和层系技术进行别离，得到tPA 溶液。经过浓缩，葡聚糖 G-150 凝胶层次，冷冻枯燥，得到精制 tPA 干粉。第四章1 细胞破碎的方法：机械破碎法 通过机械运动产生剪切力 , 使组织 细胞破碎 物理破碎法 通过各种物理因素 , 使组织 细胞的 外层结构破坏,而使细胞破碎 化学 通过各种化学试剂对细胞膜的作用 ,从而使细胞破碎 酶促 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化

14、作用 , 使细胞外层结构受到破坏 , 从而到达细胞破碎2. 酶提取主要方法： 盐溶液提取 酸 碱 有机溶剂提取3 酶沉淀别离方法的原理 P-91 表 4-3特点：盐析法 主要用于蛋白类酶的别离纯化 ,盐析时,温度一般维持室温 ,对温度敏感的酶应低 温条件,溶液的 PH 应调 到欲别离的酶等电点附近等电点 主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。加酸或加碱的过程中 , 要一边搅拌一边慢慢加 , 以防局部过酸或过碱 , 引起酶变性失活。有机溶剂 别离效果受溶液 PH 的影响。该方法比盐析法洗出的沉淀易于离心或过滤别离 , 不含无 极盐, 分辨率也高 , 但容易引起酶变性失活 ,所以必须在

15、低温条件下操作 ,而且沉淀析出后要 尽快别离,减少有机溶剂对酶的影响 复合 复合沉淀剂与酶形成复合物，溶解度降低酶工程最终版选择性 对酶没有明显影响4 膜别离技术 借助一定孔径的高分子膜，将不同大小 不同形状 不同特征的物质颗粒或分子进行别离 的技术称为 应用 超滤 蛋白质除盐 浓缩及别离纯化反渗透 海水淡化 电场膜别离：脱盐 海水淡化纯水制备，从发酵液中别离柠檬酸，谷氨酸及 凝胶电洗脱。5 超临界萃取 又称超临界流体萃取， 是利用欲别离物质与杂质在超临界流体中溶解度不同而到达别离 的一种萃取技术 特 点 P-129双水相利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解度不同而到达别离特点 P-128 影响

16、因素第 3段6 离子交换层析 利用离子交换剂的可解离集团对各种离子的亲和力不同而到达别离目的一种层析分 离方法。 要点 离子交 换剂的选择 处理 装柱 上柱 洗脱和收集再生操作要点亲和 利用生物分子与配基之间所具有的可逆亲和力，使生物分子别离纯化的技术 控制好温度 PH 等条件，以免酶失活 母体和配基的偶联结合凝胶 利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而到达物质别离的一种层析技术制备胶时，防止气泡产生，为此将各种所需比例的贮存液混合以后，应该抽气处理 2 洗脱液体积一般为凝胶床体积的 120%3 上柱体积为凝胶床 10% ，不得超过 30% 凝胶的选择与处理 装柱 上柱 洗脱7 连续凝胶

17、电泳：只用一层凝胶，采用相同的 PH 和相同的缓冲液不: 采用 2 或 3 层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用 2 中不同的 PH 和不同缓冲液，能使浓度较低的各种组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率梯度 ：采用自上而下浓度逐渐升高，孔径逐渐减小的梯度凝胶电泳。主要测定球类蛋白质的分子 质量SDS 凝胶电泳 巯基乙醇能使蛋白质分子中二硫键复原， SDS 能使蛋白质分子的请柬， 疏水键翻开，并 与蛋白质分子 结合。为此，蛋白质一 SDS 复合物迁移速率不再受蛋白质原有电荷及分子形状影响， 只取决于蛋白质相对分子质量。8 酶结晶方法 盐析 有机溶剂 透析平衡 等电点 温度差 金属离子复合 9

18、技术 ：细胞破碎 提取 细心别离 过滤与膜别离 沉淀别离 层析别离电泳别离 萃取别离 浓缩 枯燥 结 晶第五章酶的分子修饰1 ，试述酶分子修饰的概念和作用 答：概念：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变从而改变酶的催化活性的技术过程。 作用：酶的分子结构发生某些合理改变有可能提高酶的催化效率，增加酶的稳定性，降低或消除酶的 抗原性，改变酶的底 物专一性。同时在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。2，何谓金属离子置换修饰？简述其主要修饰过程和作用 答：概念：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子使酶的催化特性 发生改变的修饰方法。过程：酶的别离纯化，除去原有的金属离子，参加置换离子作用： 1，

19、说明金属离子对酶的催化作用的影响 2，提高酶的催化效率 3，增强酶的稳定性 4，改变酶 的动力学特性 3，何谓大分子结合修饰？有何作用？ 答：概念：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶的分子空间构象发生改变， 从而改变酶的催 化特性的方法。作用： 1 ，通过修饰提高酶的催化效率2，增强酶的稳定性 3，通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性4，简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用定点突变：指在 DNA 序列中的某一特定位点上进行碱基的改变，从而获得突变基因的操作技术酶工程最终版过程： 1，新酶分子结构的设计 2，突变基因碱基序列确实定 3，突变基因的获得 4，新酶的获得 应用

20、：定点突变技术为氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰提供了先进可靠行之有效的手段。 抗体酶：是一类具有催化功能的抗 体1953 年德国的格鲁布霍费 Grubhofer 和施莱恩 Schleith 采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮 化法活化后，分 别与羧肽酶，淀粉酶，胃蛋白酶，核糖核酸酶等结合而制成固化酶。固定化酶是指固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反响的酶。 固定化方法：吸附法，包埋法，结合法，交联法和 热处理法等。吸附法：利用各种固体吸附将酶或含酶菌体吸附在其外表上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定的方法。包括凝胶包埋法

21、和半透膜包埋法。结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法称为结合法。交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，生成网状结构的固定化酶法称为交联法。热处理法： 将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间， 使酶固定在菌体内而制备得到固定化酶的方法。 只适应热稳定 性较好的酶的固定化固化酶特性：1. 稳定性 1热稳定性提高 2保存稳定性好 3 对蛋白酶的抵抗性增强不易被蛋白酶水解4 对变性剂的耐受性提高2. 最适温度 与游离酶差不多，活化能变化不大，局部固化酶最适温度与游离酶相比，有明显变化。3. 最适 PH 影响固化酶 PH 因素主要有两个 1 载体带电性质，明显

22、影响。 2产物性质对最适 PH 影响， 有一定影响4. 底物特异性 不同于游离酶，其变化与底物分子质量的大小有一定关系。固化酶应用：工业产业，医药，食品，轻工，分析，环保，能源和科学研究 通过各种方法将细胞固定在水不溶性的载体上，纸杯固定化细胞的过程称为细胞固定化。 特点：提高产率，增加稳定性，利 于别离纯化，提高产品质量。固定化微生物细胞应用：发酵和制成微生物电极 固定化植物细胞：人工种子，生产色素，香精 固定化动物细胞：生产疫苗第七章1. 简述酶非水相催化的概念与特点？ 答：酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化。它是通过改变反响介质，影响酶 的外表结构和活性 中心，从而改变酶的催化特

23、性。主要内容包括有机介质中的酶催化，气相介质中的酶催化，超临界流体介 质 中的酶催化和离子液介质中的酶催化等。由于在非水相介质中酶分子受到非水介质的影响，起催化特性 与在水相中的有较大的 不同。酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中有显著地提高，而且催化时，酶的 底物特异性、立体选择性、区域选择性、键 的选择性和热稳定性都有所改变，同时酶在离子液中的催化作 用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键的选择性等 显著特点。2. 酶在有机溶剂介质中与在水溶液中的特性有何改变？答：底物专一性：酶在水溶液中进行催化反响时，具有高度的底物专一性，或称为底物特异性，是酶催化反响的显著特点之一。在有机介质

24、中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生了某 些变化，致使酶的底物特异性发生改变。对称体选择性：酶在有机介质中催化，由于介质的特性发生改酶工程最终版变，从而引起酶的对称体选择性也发生改变。酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机介质中，酶的立体选择性较差。区域选择性：酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够 选择底物分子中某一区域的基团优先进行反响。键选择性：在同一个底物分子中有两种以上的化 学键都 可以与酶反响时，酶对其中一种化学键优先进行反响。热稳定性：许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是

25、由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。 PH特性：在水溶液中，缓冲液的 PH 决定了酶分子活性中心基团的解离状 态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和 催化反响。在有机介质反响中，酶所处的PH 环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所用的缓冲液PH相同这种现象称为PH印记或PH记忆。酶在有机介质中催化反响的最适 PH 通常与酶在水溶液中反响的最适 PH 接近或者相同。3. 什么是必需水和水活度？水对非水相中酶的特性有何影响？ 答：必需水：维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为 必需水。水活度Aw:是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。 通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯

26、 水的蒸汽压之比表示。 即 Aw=P/P0 式中， P 为在一定条件下体系中水的蒸汽压； P0 为在相同条件下纯水 的蒸汽压。影响：水对酶分子空间构象的影响：酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。所以，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。水对酶催化反响速度的影响：有机介质中水的含量对酶催化反响速度有显著影响。有的酶在水含 量较低的条件下，酶的催化反响速度随水含量的增高而升高。 在催化反响速度到达最大时的水含量称为最 适水含量。在有机介质体系中， 酶的催化活性会随着结合水量的增加而提高。在结合水量不变的条件下， 体系中水含量

27、的变化对酶的催化活性影响不大。4. 有机溶剂对酶催化有何影响？答：有机溶剂对酶结构与功能的影响：有机溶剂对酶分子外表结构的影响；有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响，主要是通过有机溶剂与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物的结合能力，从而影响酶的催化活性。有机溶剂对酶活性的影响：极性较强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境 的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。 有机溶齐 U 对底物和产物分配的影响：有机 溶剂极性过大或过小都会影响底物的浓度从而影响酶的催化速度。5. 如何控制有机介质中酶催化反响的条件？答：对酶的选择不但要看催化反响速度的大小，还要特别注意酶的稳定性

28、、底物专一性、 对映体选择性、区域选择性、键选择性等底物的选择和浓度控制：根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物并且使底物浓度持续维持在一定的浓度范围内。酶在有机介质中进行催化时，要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况。有机溶剂的选择：它的极性选择要恰当，不能过强或过弱。水含量的控制：使反响体系保持在最适水含量。温度控制：最好在最适温度。PH的控制：保持在最适 PH, 可以通过 调节缓冲溶液的 PH 和离子强度的方法对有机介质中酶催化的PH 和离子强度进行调节控制。6. 举例说明酶非水相催化的应用？答：手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备 酚树脂的合成 导电有机聚合物的合成 发光

29、有机聚合物的合成 食品添加剂的生产 生物柴油的生产 多肽的合成 甾体转化 知识点：行催化反响；还可以( 1)酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反响；也可以在水和有机溶剂组成的双液相体系中进在只含有微量水的有机介质，又称为微水介质中进行催化反响。( 2) 非水酶学就是酶非水相催化。(3)酶的非水相催化工酶在有机介质中的催化。( 4)在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反响。适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。3)与水不溶性有( 5)有机介质体系包括： ( 1) 微水介质体系 ( 2) 与水溶性有机

30、溶剂组成的均一体系 (机溶剂组成的两相或体系 ( 4)正胶束体系 ( 5) 反胶束体系。微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反响体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反响酶工程最终版 体系。通常所说的有机介质反响体系主要是指微水介质体 系。能在与水溶性有机溶剂组成的均一体系中进行催化反响的酶较少。 胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少 量与水不相混溶的有机溶剂，参加外表活性剂 后形成的水包油的微小液滴。外表活性剂的极性端朝外， ，非极性端朝内，有机 溶剂被包在液滴内部。反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，参加外表活性剂 后形成的油包水的微

31、 小液滴。外表活性剂的极性端朝内， ，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。不管采用何种有机介质反响体系，酶催化反响的介质中都含有有机溶剂和一定量的水。(6)在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与甲醇的酯交换反响，生成生物柴油。第八章 酶定向进化思考题1. 酶定向进化 : 是模拟自然进化的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控 制条件的特殊环 境下，定向选择得到具有优良催化特性酶的突变体的技术过程。酶定向进化的特点： 1 适应面广、目的性强、效果显著。 酶定向进化的根本过程包括随机突变、构建突变基因文库、酶突变基 因的定向选择等步骤。2. 易错 PCR 是在采用 DNA 聚合

32、酶进行目的基因扩增时，通过调整反响条件，如提高镁离子浓度、参加锰离子、改变体系中四种的 dNTPs 浓度或运用低保真度 DNA 聚合酶等，增加碱基配对错误的出现频率， 而引 起基因突变。通 常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此可以采反复屡次易错PCR 方法。即将一次易错 PCR 扩增得到的正突变基因作为下一次易错的模板，在进行易错 PCR 如此反复进行，直至获得较为满意的结果为止。3. DNA 重排技术是从正基因突变文库中别离得到的同源DNA, 用酶切割成随机片段，经过不加引物的屡次PCR 循环，使 DNA 的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA 重排技术将两条或多条正突变

33、基因通过脱氧核糖核酸酶等酶的作用，随机切割成假设干DNA 片段，然后将这些随机片段在不加引物的条件下经过屡次PCR 循环，使这些 DNA 随机片段互为模板和引物进行扩增、延伸，再参加适宜的引物进行PCR 反响，获得全长的基因。经过一次DNA 重排获得的突变基因往往骤，直到获得所需的未能到达人们的要求，为此，需要经过构建突变文库和筛选的过程，获得的正突变基因在反复经过上述步 突变基因为止4. 基因家族重排技术：是从基因家族的假设干同源基因出发，用酶切割成随机片段，将经过不加引物的屡次PCR 循环，使 DNA 的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基因家族重排技术与 DNA 重排技术的根

34、本过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR 等步骤以获得突变基因，然后通过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。基因家族重排技术与 DNA 重排技术的主要不同点在于前者从基因家族的假设干同源基因出发进行DNA 序列DNA 序列的重新的重新排布，而后者那么从采用易错 PCR 等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行 排布 其他内容：体外随机突变的技术主要有：易错 PCR 技术、 DNA 重排技术、基因家族重排技术。 易错 PCR 技术所引起的基因突变和遗传 进化仅在单一分子内发生，所以属于无性进化。DNA 重排技术将存在于两种或多种不同基因中的正突变结合在一起，通过

35、 DNA 碱基序列的重新排布，形 成新的突变基因，属于用性进化。突变基因文库的构建是将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组入噬菌体的技 术过程。 构建突变基因文库的过程主要包括载体的选择、基因重组、形成基因文库等。 高通量筛选技术包括：平板筛选法、荧光筛选法、 噬菌体外表展示法、酵母细胞面展示法。第九章1. 酶反响器的类型：搅拌罐式反响器，鼓泡式反响器，填充床式反响器，流化床式反响器，膜反响器酶工程最终版2. 选择酶反响器的主要依据有：根据酶的应用形式选择；根据酶反响动力学性质选择；根据底物或产物 的理化性质选择；其 他影响因素：所选择的反响器应当能够适用于多种酶的催化反响，并能满足酶催 化反响所需的条件，并可进行适当的调节 控制。3. 酶反响器设计的主要内容：反响器类型的选择，反响