5FU代谢酶基因型多态联合检测与胃肠癌化疗的评估 已打印

1、江苏省科技计划项目任务书项目名称： 5-FU代谢酶基因型多态联合检测与胃肠癌化疗的评估 承担单位： 江苏省肿瘤医院所在地区： 南京市单位地址： 南京市玄武区百子亭42号 邮编： 210009 项目负责人： 陆建伟 电话： 3283510主管部门： 江苏省卫生厅 申报日期：2003年 05月 16日江苏省科学技术厅二三年制一、 立项依据1、 本项目国内外科技创新发展概况和最新发展趋势；胃肠道癌是最常见的恶性肿瘤。目前我们收治的病例多数为进展期，单纯手术常难以根治，化疗在综合治疗中发挥了重要作用，成为治疗胃肠道癌的主要方法之一。5氟尿嘧啶（5FU）是治疗胃肠道癌最常用的化疗药物之一。5FU进入体内

2、后，大约85的药物被二氢嘧啶脱氢酶（DPD）灭活。其余部分被胸苷磷酸化酶转化成FUdR。在胸苷激酶的催化下，FUdR进一步磷酸化为有活性的5FU代谢物，5氟2脱氧尿苷一磷酸(FdUMP)。在还原型叶酸辅因子即5，10亚甲基四氢叶酸（MTHFR）存在条件下，FdUMP与胸苷酸合成酶（TS）形成一种稳定的共价络合物。TS能催化dUMP形成dTMP，TS导致dTMP的耗竭，从而干扰DNA的合成和修复。因此在这个过程中，DPD、TS以及MTHFR表达增高将对5FU的抗瘤活性和毒性具有一定的影响。DPD是一种5FU分解代谢限速酶。在不同个体中，其活性最大波动范围可达20倍。DPD活性低的患者不能有效灭活

3、5FU，导致过量生成5FdUMP，从而引起致命的胃肠、血液、神经毒性，反之，则降低5FU的抗瘤作用。目前认为DPD存在遗传性缺乏。迄今至少报道了20种与DPD活性降低相关的基因突变。在人群中，35的个体携带灭活DPD的基因突变杂合子，01的个体携带DPD基因突变纯合子。认为约50的DPD灭活等位基因是非功能性等位基因。是由邻接DPYD基因第14外显子的GT拼接供位恒定区发生了GA转位突变所致。该等位基因（各为DPYD2A）导致第14外显子的遗漏（不表达），从而引起一种无功能的蛋白质表达。一些研究认为DPYD2A等位基因与5FU化疗引起的毒性和疗效相关1。但是在一些5FU严重毒性反应的患者中并没

4、有检测到DPYD基因编码突变2。使DPD活性调控分子机制变得错综复杂，需要扩大病例进一步研究。已经证实TS基因的遗传多态性对5FU的化疗疗效具有较大的影响。TSmRNA和蛋白水平均与5FU的临床抗肿瘤效应呈负相关。TS基因5端启动子中的一个串联重复序列（TSER）存在多态性。它含有多个拷贝重复序列的等位基因，分别命名为TSER2（2R）、TSER3（3R）、TSER4（4R）、TSER5（5R）、TSER9（9R）。研究显示2R、3R是最重要的等位基因型3。在中国和日本人中3R3R基因型的发生率（67）明显高于白种人和西亚人（38）。许多实验研究认为增加重复序列的数量导致TSmRNA水平及蛋白

5、质表达的升高。2000年Uricht等4通过检索表达顺序标签库发现TSmRNA 3非翻译区的（3-untranslated region, 3-UTR）的1494bp处存在6bp核苷酸片段的缺失或插入。最近我院分子流行病研究室发现TS基因的这一多态性与胃癌的发生有协同关系5，但与癌症治疗的关系国内外未见报道。Pullarkatt等6发现3R3R纯合子个体的TSmRNA水平比2R2R纯合子个体高36倍，比2R3R杂合子个体高17倍。在50例结直肠癌病例中，2R2R纯合子患者的5FU化疗的有效率（50）明显高于3R3R纯合子（9）和2R3R杂合子（15）患者。Yoshinori等7对115例术后口

6、服5FU化疗胃癌病例进行TS基因型分析，发现3R3R纯合子患者的生存明显差于2R2R和2R3R患者。因此胃肠道病人TS基因型的遗传多态性的检测有可能成为5FU化疗疗效的预测指标。MTHFR是调节叶酸代谢的限速酶。MTHFR的底物5，10亚甲基四氢叶酸参与TS将脱氧尿苷(dUMP)转化为脱氧胸苷一磷酸(dTMP)的过程。同时5，10亚甲基四氢叶酸通过MTHFR代谢成为5甲基四氢叶酸，后者再经蛋氨酸合成酶的催化作为甲基供体使同型半胱氨酸转化为蛋氨酸。研究发现MTHFR具有基因遗传多态性，其中最常见的是677CT多态和1298AC多态，前者在677位点发生CT改变，后者在1298位点发生AC改变，M

7、THFR基因这两个位点的改变都使其编码的酶活性显著降低。从而导致叶酸代谢障碍，使5，10亚甲基四氢叶酸积聚。中国人MTHFR677CT变异基因型（CTTT）拥有者的比例（685）高于西方人群（553），欧美人群中MTHFR 1298 AC变异高于东亚地区人群。我院分子流行病研究室在国内外率先进行了MTHFR基因多态与胃癌关系的研究，并发现胃癌患者的677CT变异基因型比例占7948。加拿大作者Cohen等9发现结直肠癌患者MTHFR677CT变异基因型的比例为61，研究显示拥有纯合子（CC）基因型患者经5FU为主方案化疗的有效率47，而拥有杂合子和变异型纯合子患者的有效率分别为67和100。因

8、此MFHFR基因遗传多态性与5FU化疗疗效之间具有相关性。综上所述，联合分析DPYD基因型突变与TSER和MTHFR基因的多态性可能成为胃肠道癌患者对5FU化疗疗效和毒性的预测指标，以及在确定哪些患者需要（TS、MTHFR高表达和DYPD缺乏）选择其它有效的化疗药物来替代5FU治疗时，显得特别重要。迄今为止，国外对这些基因组仅有检测单一指标的小样本报道，国内仅局限于肿瘤易感性方面的研究，尚无将这些基因组分析结果用于指导临床化疗方面的报道。本研究对5FU抗癌活性中三个关键酶的基因型多态性进行联合分析，将较全面地阐明胃肠道癌患者5FU代谢过程中存在的个体差异，从而达到个体化治疗。参考文献：1.M.

9、 Raida, W. Schwabe, P. Hausler, A.B. Van Kuilenburg, A.H. VanGennip, D. Behnke, K. Hoffken, Prevalence of a common point mutation in the dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) gene within the 5V-splice donor site of intron 14 in patients with severe 5-fluorouracil (5-FU)-related toxicity compared wit

10、h controls, Clin. Cancer Res. 7 (2001) 28322839.2. E.S. Collie-Duguid, M.C. Etienne, G. Milano, H.L. McLeod, Known variant DPYD alleles do not explain DPD deficiency in cancer patients, Pharmacogenetics 10 (2000) 217223.3. H.R. Luo, X.M. Lu, Y.G. Yao, N. Horie, K. Takeishi, L.B. Jorde, Y.P. Zhang, L

11、ength polymorphism of thymidylate synthase regulatory region in Chinese populations and evolution of the novel alleles, Biochem. Genet. 40 (2002) 41 51.4. Ulrich CM, Bigler J, Velicer CM, Greene EA,et.al. Searching expressed sequence tag databases: discovery and confirmation of a common polymorphism

12、 in the thymidylate synthase gene. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000 Dec;9(12):1381-55. 高长明，吴建中，丁建华，等。胸苷酸合成酶基因多态性和生活习惯、亚甲基四氢叶酸还原酶基因协同作用与胃癌的易感性。中华流行病学杂志，2003；24（7）：4347（待发表）6. S.T. Pullarkat, J. Stoehlmacher, V. Ghaderi, Y.P. Xiong, S.A. Ingles, A. Sherrod, R. Warren, D. Tsao-Wei, S. Groshen, H.J

13、. Lenz, Thymidylate synthase gene polymorphism determines response and toxicity of 5-FU chemotherapy, Pharmacogenomics J. 1 (2001) 6570.7. Ishida Y, Kawakami K, Tanaka Y, Kanehira E,et al. Association of thymidylate synthase gene polymorphism with its mRNA and protein expression and with prognosis i

14、n gastric cancer. Anticancer Res 2002 Sep-Oct;22(5):2805-98.高长明，吴建中，丁建华，等。亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与胃癌易感性的关系。中华流行病学杂志，2002； 23（4）：2892939Cohen V, Panet-Raymond V, Sabbaghian N, Morin I,et al. Methylenetetrahydrofolate Reductase Polymorphism in Advanced Colorectal Cancer:A Novel Genomic Predictor of Clini

15、cal Response to Fluoropyrimidine-based Chemotherapy. Clin Cancer Res 2003 May;9(5):1611-16152、 本项目研究的目的、意义（突出说明对科技、经济和社会发展的作用）；本研究的目的：1 采用PCR技术，分析胃肠道癌患者外周血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TS（TSER、TS3'UTR）和MTHFR（C677T、A1298C）基因型的多态性。2 联合分析DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因的多态性与5FU化疗疗效和化疗毒性的关系。3 联合分析DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因的多态性与胃肠

16、道癌患者预后的关系。本研究的意义通过对胃肠道癌患者外周血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型的多态性分析，预测胃肠道癌患者对5FU化疗疗效和毒性的个体差异，提高5FU用药的安全性和有效性，避免无效治疗和不良反应，从而降低治疗费用和风险。具有较好社会效益和经济效益。同时通过这些基因组多态性与预后关系分析，为胃肠道癌建立一个新的预后指标。3、 本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况（高技术、科技攻关计划附查新报告）；药物基因组学（pharmacogenomics）是上世纪90年代末发展起来的基于功能基因组学（funetional genomics）与分子药理学的一门新

17、兴学科。它从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，即：研究基因本身及其突变体对不同个体药物作用效应差异的影响。本研究从基因水平上揭示DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型多态性的遗传特征，通过鉴别基因序列中的差异，以5FU药物效应及安全性为目标，研究DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型多态性与5FU疗效和安全性之间的关系。因此具有较高科学水平。4、 本项目研究国内外竞争情况及产业化前景。 本项目的研究内容在国外的大部分报道的是实验室研究结果，与临床化疗相关的报道较少，并且仅局限于大肠癌的小样本单指标检测。国内未见类似报道。本项目是联合检测5FU代谢过程中的三个关键酶

18、基因组变异，病种是以胃癌为主的胃肠道癌。因此本研究内容属国外、国内领先。二、 研究内容1、 具体研究开发内容和要重点解决的关键技术问题；选择晚期胃肠道癌患者（均具有可测量病灶）200例，采用PCRRFLP技术检测胃肠道癌患者外周静脉血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TSER（2R2R、2R3R、3R3R）、TS3'UTR(+6bp/+6bp、+6bp/-6bp)、6bp/-6bp)和MTHFRC667T（CC、CT、TT）、C1298A（AA、AC、CC）基因型多态性。a) 所有病例均给予以5FU为基础的方案化疗。b) 分析DPYD基因型突变和非突变型与5FU化疗疗效和化疗毒性的关系

19、c) 分析TS基因型多态性与5FU化疗疗效和化疗毒性以及预后的关系d) 分析MTHFR多态性与5FU化疗疗效和化疗毒性以及预后的关系e) DPYD基因、TS基因型、MTHFR多指标联合分析基因突变和多态性与5FU化疗疗效和化疗毒性以及预后的关系f) 技术创新之处：采用PCR-RFLP技术检测胃肠道癌患者外周静脉血DNA中的DPYD基因组突变和TS、MTHRF多态性。以外周血白细胞DNA为检测样本，无需瘤组织，方法简便易行，易于推广应用。而国外大部分报道是检测肿瘤组织细胞内DNA的基因变异，其缺点在于检测标本来源困难。2、项目的特色和创新之处；本研究的创新之处在于将胃肠道癌与5FU治疗的有效性和

20、安全性从传统的临床指标上升到药物基因组学水平，从药物遗传基因多态性水平为胃肠道癌患者提供了个体化治疗（所谓的：基因处方）的理论依据。3、 要达到的主要技术、经济指标及社会、经济效益。本研究如果能达到预期目的，将为胃肠道癌患者对5FU化疗疗效和毒性提供可靠的预测指标，从而避免无效治疗和不良反应，降低治疗费用和风险。三、 研究试验方法、技术路线以及工艺流程本研究为临床与实验室相结合的研究，本研究选择的病例为晚期具有肿瘤病灶的胃肠道癌患者，分临床和实验室二大部分。（一） 临床部分1 详细的病史记录和体格检查，包括年龄、性别、发病时间、确诊时间，症状，体征、原发肿瘤部位、复发肿瘤部位。2 常规实验室资

21、料，包括：血常规、尿常规、大便常规、肝功能、肾功能、电介质、CEA、CA199。心电图。3 病理学类型。4 每个病例均抽取外周静脉血2ml，分离白细胞，提取DNA，30度冰箱保存。5 影像学资料包括CT、MRI、B超、X线胸片等。证实入选病例具有可测量病灶。治疗方法：所有病例采用以5FU为基础化疗方案化疗。化疗方案：LFLH方案CF200 mg/m2/d,iv.gtt. d1-5,2h 5-FU 500 mg/m2/d,iv.gtt. d1-5,24h LOHP 100 mg/m2/d,iv.gtt. d1,4h HCPT 6 mg/m2/d,iv.gtt. d1-5,4h 以上化疗方案以21

22、天为1周期，连续2周期评价疗效和毒性。6 化疗疗效评定标准参照WHO疗效评定标准评定。化疗毒副反应按照WHO标准进行分级。（二） 实验室部分1标本：静脉血置乙二胺四乙酸钠抗凝管，分离白细胞层，用QIAampDNA提取试剂盒提取白细胞DNA，DNA置30度低温冰箱保存备用。2基因型分析：参照文献的方法1,4,6,8，用PCR-RFLP技术检测研究对象的DPYD基因型,用本院流行病研究会已经建立的方法检测TS和MTHFR基因型。所用引物：（1）DPYD基因型DPD14f：5'-TCCTCTGCAAAAATGTGAGAAGGGACC-3'DPD14r：5'-TCACCAACT

23、TATGCCAATTCTC-3'NDEf：5'-ATCAGGACATTGTGACATATGTTTC-3'NDEr：5'-CTTGTTTTAGATGTTAAATCACACATA-3'检测DPYD基因型中IVS14+1G>A突变型。 （2）TS基因型：TSER基因型：Primer15'-GTGGCTCCTGCGTTTCCCCC-3'Primer25'-GCTCCGAGCCGGCCACAGGCATGGCGCGG-3'检测野生型纯合子（2R2R）、杂合子（2R3R）、变异型纯合子（3R3R）三种基因型TS3'UTR基

24、因型：Primer15'-CAAATCTGAGGGAGCTGAGT-3' Primer25'-CAGATAAGTGGCAGTACAGA-3'检测野生型纯合子(+6bp/+6bp)、杂合子(+6bp/-6bp)、变异型纯合子(6bp/-6bp)（3） MTHFR基因型： 677CT:Primer1 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' Primer2 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3'检测野生型纯合子（CC）、杂合子（CT）、变异型纯合子（TT）三种基因型。 1298AC：Primer15&#

25、39;-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3'Primer15'-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3' 检测野生型纯合子（CC）、杂合子（CA）、变异型纯合子（AA）三种基因型。（三）结果分析：用SPSS100版统计软件。评价胃肠道癌患者外周血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TS（TSER、TS3'UTR）和MTHFR（C677T、A1298C）基因型多态性与以5FU为基础化疗方案化疗疗效以及与生存的关系。单因素分析用卡方检验，多因素分析用Cox回归，生存分析用卡迈生存曲线。（四） 技术路线：选择入组对象以5FU为基础方案化疗

26、（LFLH方案）抽取静脉血 提取白细胞DNA30度冰箱保存生存期观察毒性观察疗效评价DPYD、TS、MTHFR基因型分析分析DPYD基因突变和TS、MTHFR基因型多态性与疗效、毒性、生存的关系四、工作基础和条件1、 承担单位概况（人员、资产、业务与管理状况），拥有知识产权状况（包括本项目已有知识产权状况）；本项目负责人陆建伟副主任医师为中华医学会南京市分会胃肠道疾病专业委员会委员。2002年赴日本爱知县癌中心短期研修。曾获省卫生厅新技术引进一、二等奖各1项。已完成一项省科技厅资助的应用基础项目。高长明博士为中国抗癌协会流行病学专业委员会委员、江苏省抗癌协会理事，目前正承担由日本文部省国际学术

27、研究癌症特别研究经费资助的MTHFR、TS基因型多态性与胃肠道癌易感性关系的研究。参与本项目的人员中博士3名、硕士2名。江苏省肿瘤医院业务副院长冯继锋副主任医师和肿瘤内科行政副主任潘良熹主任医师、普外科行政副主任陈环球副主任医师作为本项目的项目协调人。2、 本项目现有的研究工作基础（包括与本项目研究有关的主要论文、专著情况，小试或中试成果情况，现有装备条件等）;我院分子流行病研究室已经成功完成了一项与日本文部省国际学术研究癌症特别研究经费资助的MTHFR（C677T、A1298C）、TS（TSER、TS3'UTR）多态性与消化道癌易感性关系的研究。近年来已完成十多个基因多态性与消化道癌

28、易感性关系的研究，并已在国内外杂志上发表研究论文十多篇。最近发表的论文：1 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与胃癌易感性的关系。中华流行病学杂志，2002； 23（4）：2892932 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与食管癌易感性的关系。肿瘤，2002；22（4）：2682703 胸苷酸合成酶基因多态性和生活习惯、亚甲基四氢叶酸还原酶基因协同作用与胃癌的易感性。中华流行病学杂志，2003；24（7）：4347（待发表）我院肿瘤内科有多年治疗晚期胃肠道癌化疗经验。目前已建立了胃肠道癌患者外周血DNA库。已经检测了35例胃癌患者外周血DNA中MTHFRC677T多态性。所有患者均

29、采用LFLH方案化疗2周期。初步结果提示51的胃癌患者（18例）表现为CT、TT二种基因型，有效率达72，其中4例达到完全缓解；而17例表现为CC基因型患者的有效率仅为35，没有完全缓解病例。可见CT、TT二种基因型患者的化疗有效率明显高于CC基因型患者。3、 项目负责人以往承担国家、省级等各类科技计划项目完成情况（立项年度、项目编号、项目名称、计划类别、完成时间、完成效果）；（1）【化放同时治疗III期非小细胞肺癌的随机对照研究】省科委1999年8月 BJ99065 陆建伟（本项目负责人）2003年3月已结题。【MTHFR（C677T、A1298C）、TS（TSER、TS3'UTR）

30、多态性与消化道癌易感性关系的研究】日本文部省国际学术研究癌症特别研究经费资助08042015高长明（本项目第2负责人）为中方负责人（2）主要科研成果奖励名 称获奖种类及级别等级获奖时间主要负责人低剂量5氟脲嘧啶持续输注联合低剂量顺铂治疗晚期消化道恶性肿瘤省卫生厅新技术引进二等奖2000年陆建伟FOLFOX方案治疗晚期胃肠道癌省卫生厅新技术引进一等奖2002年陆建伟银染TPA法检测端粒酶活性及其临床意义省卫生厅新技术引进二等奖2000年高长明江苏省恶性肿瘤流行特征及动态研究省科技厅四等奖1997年高长明 4、项目实施具备的人才队伍、经费配套投入能力及科技服务管理能力；我院是全省唯一的一所技术力量

31、雄厚，诊治设备齐全的三甲肿瘤专科医院，肿瘤内科是全国最大的肿瘤化学治疗中心之一，是我省肿瘤内科治疗、教育、科研中心。拥有五个病区200多张标准病床，各类各级肿瘤内科专业人员38人，其中高级职称人员11人，有30多年肿瘤内科科研和临床诊治经验。全国化疗专业委员会委员郑秀立主任和江苏省抗癌协会副理事长、江苏省化疗专业委员会主任委员黄富麟主任是全国著名胃肠道肿瘤内科专家。全年收治胃肠道肿瘤病例400例以上，占全年内科总病例的40左右，居全部肿瘤病种之首。我院分子流行病研究室长期从事肿瘤分子流行病研究，同时与日本爱知县癌中心、浜松医科大学、鹿儿岛大学医学部以及韩国汉城大学医学部已有多年研究合作关系。

32、本项目负责人陆建伟副主任医师已完成一项省科技厅资助项目，具有一定的科研管理经验。高长明博士长期从事肿瘤分子流行病研究，目前正承担一项国际协作科研项目，具有丰富的科研管理能力。5、本项目实施可能对环境的影响及预防治理方案。本项目在实施过程中对环境无任何影响。五、 项目研究预期成果及效益（重点是能提交的具有自主知识产权的创新性成果、高新技术产品、新样机、新设备、新品种、计算机软件、技术标准，以及在成果转化中可能产生的效益等）本研究有望为今后胃肠道癌化疗提供一个个体化化疗的预测指标，提高5FU用药的安全性和有效性，避免无效治疗和不良反应，从而降低治疗费用和风险。具有较好社会效益和经济效益。并用于指导胃肠道癌术后辅助治疗。同时通过这些基因组多态性与预后关系分析，为胃肠道癌建立一个新的预后指标。六、 计划进度安排与考核指标工作进度（按半年度分）主要工作内容2003年8月至2004年2月收集病例、标本、化疗、检测基因指标60例2003年3月至2004年9月收集病例、标本、化疗、检测基因指标60例2004年10月至2005年3月收集病例、标本、化疗、检测基因指标60例2005年4月至2005年10月完成所有病例、标本、化疗及检测工作2005年11月至2006年4月分析各项指标与化疗疗效和毒性的关系2006年5月至20