高通量药物筛选与创新药物研究--国家新药筛选中心

1、高通量药物筛选与创新药物研究-国家新药筛选中心 Microplates from Corning Matrix of Wells 864 96 384 1536 WellRowColumnVolume 96812300 3841624100 1536324810 Microplates 微孔板的颜色和材料 颜色类型 应用 透明 光吸收检测 不透明 黑色荧光检测 白色化学发光检测 底部透明 细胞实验底部检测 材料类型 应用 聚苯乙烯PS 疏水性透明度高多用于筛选板 聚丙烯 PP 化学稳定性高适合化合物储存 UV透射材料 光吸收率低适合UV检测 Microplates 微孔板微孔的设计和密度 微孔

2、板微孔密度的增加可以显著提高单位时间内筛选的通量 节约成本 提高筛选质量 微孔密度 96孔 384孔 1536孔 3456孔 微孔容积 75-250 mL 20-100 mL 2-10 mL 1mL Microplates 微孔板材料的表面处理 类型 应用 与生物分子无亲和力 Corning公司NBSTM微孔板均相生化测试 与生物分子高亲和力 非均相测试 例如ELISA DELFIA 为细胞组织培养特别处理 Corning公司的CelllBind微孔板提高细胞贴壁性 多聚赖氨酸表面 超低细胞亲和力表面降低细胞贴壁能力 共价处理表面 与DNA碳链巯基有特异的亲和力 微孔板设备 一般而言一个自动化

3、筛选系统的大多数组件总是围绕微孔板而工作的它们均可称为微孔板设备 独立单元Stand-alone指象洗板器液体分配器Liquid Dispenser和酶标仪等 工作站Workstation能执行多重功能通常指围绕微孔板的部分 如液体转移装置Liquid Handling可围绕微孔板执行多重功能 History 1980s Zymark 世界上第一台工作站是由Zymark公司开发的BenchmateTM系统它集成了精密天平单通道加液头移液装置振荡器和HPLC进样器等通过一个机械臂可以将不同的容器从一个工作台移至另一个工作台但这一系统主要是针对管形反应器设计而设计的并不适用于今天的微孔板 第一台基

4、于于微孔板设计的工作站是由Beckman Coulter开发的Biomek1000它整合了单通道和多通道的吸液加液洗涤和单通道检测密度测定等组件部分 Biomek2000 使用可变换工具后变得更加灵活如不同的吸收器分配器等其特点是可以针对不同的需要设计不同的操作程序 BiomekFX集成了更强大的功能如多通道可同时亦可执行不同的任务双手臂操作则更是增加了有效性和操作速度 Biomek 2000 Automation Workstation 自动化液体分配装置 Beckman Biomek FX 96-channel pipetting head High-capacity for simult

5、aneous liquid transfer Span-8 pipettor Flexible with individual movement and liquid sensing capability for hit picking and plate reformatting 检测系统 UV-visible Light Absorbance Fluorescence Fluorescence Intensity Time-resolved Fluorescence TRF Fluorescence Polarization FP Luminescence Radioactivity Mi

6、croplate Readers Spectra Plus 384 UV absorbance Continuous 190 - 1000 nm Reads 96 wells 5 sec 384 wells16 sec Spectra Gemini XS Luminescence fluorescence and time-resolved fluorescence Continuous 250-850 nm Read 96 wells 27 sec 384 wells 2 min 30 sec VICTOR2 V Multi-label Reader Filter-based instrum

7、ent Five technologies Absorbance Luminescence Fluorescence Time-resolved fluorescence Fluorescence polarization Microplate reader 最新的微孔板检测器具备高速高灵敏度通用的特点 PerkinElmer公司的EnVision 检测器可以在36s内完成对一块1536孔板的荧光强度检测 整合了光吸收荧光强度荧光偏振时间分辨荧光化学发光激光等多种检测手段 EnVision PERKINELMER Safire2 TECAN Spectra M5 Molecular Devic

8、es 自动化系统 Automated Robotic System 自动化系统是指集独立单元工作站于一个特定的功能环境由一种总系统软件控制由一至二个机械臂完成微孔板在独立单元和工作站之间的转移工作可重复编程的机械装置系统能自动重复完成包括自动称量液体转移分离仪器硬件的转移等 自动化系统的组成 机器人 控制器 机械手 伺服轨道 外围设备 微孔板设备液体转移装置培养箱洗板器液体分配器和酶标仪等 机器人类型 关节机器人 Articulated arm robots 圆柱坐标机器人 Cylindrical coordinate robots 高架机器人 Overhead gantry robots 关

9、节机器人 Articulated arm robots ORCA Robot 圆柱坐标机器人 Cylindrical coordinate robots SEICO Robot 高架机器人 Overhead gantry robots 机械手Gripper 线形伺服轨道Linear servo track 机器人通常被安装到线形伺服轨道上使它可以移动到桌面的其他位置如前所述这一点极大增加了机器人的有效工作空间并使它在无人力干预的情况下为更多的仪器服务 典型的外围设备Typical peripheral devices 微孔板存放装置 Microplate storage unit 条形码识别器

10、 Bar code scanner 液体转移Liquid transfer 培养箱 incubator Microplate storage unit stacker carousel ORCASystem Thank You Vesicle to Plasma Membrane Translocation Example Pathway Therapeutic area GLUT4 Insulin Diabetes Receptor channel recycling Endosomal Many Target GLUT4 Host cell type CHO-hIR Stimulation

11、 Insulin Timescale 20 min A human GLUT4 assay in Xcellsyz Ltd conditionally immortalized human fat and muscle cell lines is under development Cytoplasm to Membrane Translocation Example Pathway Therapeutic area PKCa Phosphoinositide Cancer PKCb Phosphoinositide Diabetic complications PKCe Phosphoino

12、sitide Cardiovascular AktPKB Growth factor Cancer Diabetes Arno PI3-K Many b-Arrestin GPCRs Many Target Akt1 PKBa Host cell type CHO-hIR Stimulation IGF-1 insulin Timescale 5 min Assay read on IN Cell Analyzer with the Membrane Spot Analysis Module MSPO 要素二化合物样品库制备 结构多样性Chemical diversity 类药性Drug-li

13、ke Lipinski规则 MW 500 ClogP 5 H bond donors 5 H bond acceptors 10 Properties of an Average Drug Undesirable Compounds Unstable Reactive Michael acceptor Toxic Liquid General metal chelator Polyaromatic metallocompound 筛选样品来源 传统化学合成分离 合成化合物 分离的天然产物纯化合物和粗提物有效部位 组合化学合成 从化合物数量和结构多样性上充实供筛选的化合物库 与其他机构的合作交换

14、或购买 传统化学合成和分离 单个合成分步纯化 一个化学工作者一年合成化合物的数量从不足一百个 特点数量相对较少但各化合物相关数据全质量较高 对特定的靶点SAR明确对一个全新靶点这些知识有助于产生新的先导化合物 组合化学 通过各反应单体之间的不同组合方式在短时间内生成大量的化合物纯的单一化合物或单一化合物的混合物供医药研究或其他用途如图示 特点 化合物数量大相对结构多样性 易于设计合成-100000 compounds and more in a year with a few chemists and automation SAR的产生 Drug-like 组合化学 发掘天然产物资源 大自然是

15、另外一个能提供具有结构多样性小分子有机化合物的主要来源 经典方法-分离纯化结构鉴定活性测试-费时效率低远远不能满足现代高通量筛选的需要这在一定程度上影响了天然产物来源的样品在近年来的药物研究中受重视程度 从结构多样性的角度考虑大自然可能给予我们的结构多样性大大高于组合化学因而天然产物或天然来源的样品的重要性不容忽视这也是现代天然产物化学研究的新的切入点 天然化合物库Nature Product Pool 尽管许多天然产物在一些特定生物模型上被筛选过但至今没有多少化合物在所有现存的模型上被广谱筛选过的事实似乎给我们这样一种信息随着新的药物筛选模型的不断涌现一些已知的天然化合物可能会被发现具有全新

16、的生物活性 天然产物对新药发现和开发的重要性 天然产物特别是植物中的天然产物作为药物用途的历史非常古老为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质 为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣 为什么最近制药企业又对来源于天然物的先导化合物产生了兴趣 为什么自然界能产生对人体疾病有效的物质 化学家和生物化学家对次级代谢产物所有非蛋白天然产物的产生提出了六种主要的假设Haslam归纳如下 1次级代谢产物是无特定生理功能的单纯排泄物 2次级代谢产物曾经起过功能代谢作用但目前其作用已失去 3次级代谢产物是所有体内变化的产物在生物体内没有任何真正的作用 4次级代谢产物是进化过程中的一例在新化合物产生之

17、前次级代谢物是为了保存进化所必需的物质而存在 5次级代谢产物为初级代谢所不需要的酶提供发挥作用的场所重要的是次级代谢过程而不是次级代谢产物 6次级代谢能产生防御物质和其他重要的生理活性物质对生物体的生存具有重要作用 为什么20世纪后半叶对从天然产物寻找新药失去了兴趣 20世纪70年代末兴起的组合化学的发展使得短期有效合成上万个化合物成为可能 随着具有自动化系统的高通量筛选技术的发展每天可以筛选50000个以上的样品为组合化学合成的样品提供一种快速筛选方法 天然生理活性物质分离的复杂化和大量生物材料获得不易 天然产物研究的复活 天然产物研究的成功 天然产物研究的独特性 新筛选方法的影响 根据新药

18、的研发过程设计有效的天然产物研究方法 天然材料的获得和提取 有效的筛选方法 天然生理活性物质的分离 快速有效的结构解析方法 生物学的评价 天然生理活性物质的大量获得 构效关系研究 天然产物或其类似物作为药品实例 61 of 877 small molecule drugs introduced worldwide during the period 1981-2002 can be traced to or were inspired by natural products 洛伐他汀 Lovastatin HMG-CoA抑制剂 CompactinR1 R2 H Mevinolin R1 CH3

19、R2 H Simvastin R1 CH3R2 CH3 Pravastatin Fluvastatin Cerivastin Atorvastin 环孢菌素ACyclosporine A 真菌Trichoderma polysporum分离 抑制器官移植排异反应的免疫抑制剂 紫杉醇 紫杉醇 1 Paclitaxel Taxol 是从太平洋红豆杉Taxus brevifolia树皮中提取分离得到的天然二萜化合物 多西紫杉醇 2 Docetaxel Taxotere 是在紫杉醇的结构修饰和改造过程中通过半合成方法得到的 2001年全世界紫杉醇年销售额在20亿美元以上多西紫杉醇年销售额达到10亿美元

20、以上这两种药物已经成为当前也是历史上最为畅销的抗癌药物 喜树碱及其衍生物 Camptothecin R1 R2 R3 H Topotecan R1 HR2 CH2N CH3 2R3 OH Irinotecan R1 CH2CH3R2 HR3 A 9-Aminocamptothecin R1 R3 HR2 NH2 9-Nitrocamptothecin R1 R3 HR2 NO2 A 喜树碱及其衍生物是DNA局所异构酶 DNA toposomerase 抑制剂 吗啡生物碱 MorphineR H CodeineR CH3 Buprenorphone活性为Morphine 2550倍成瘾性低于吗啡

21、 Pentazocine活性仅为吗啡的30但成瘾性极低 天然产物研究的未来 利用组合化学合成非天然的天然物或类天然产物库 多样性导向合成 diversity-oriented synthesis Galanthamine 四环骨架化合物库的建立和分泌途径抑制剂及高尔基-质膜运输抑制剂Secramine A 的发现 Shair M D and Kirchhausen T Nature chemical biology 2006 2 39-46 2527 compounds were synthesized Compound Storage Solid Long-term storage DMSO

22、 solution Long-term storage 10 year Working solutions Compound plates Mother Plates DMSO solutions from vendors Daughter Plates DMSO solutions 1 mgml Assay Plates Aqueous solutions 25 gmL compound 25 DMSO 20 L 80 Compounds 352 Compounds 88 Compounds Sample management technology 化合物库是医药公司和研究机构最宝贵的资产其

23、数量和质量的重要性需要高可靠性的自动化储存和检索系统 专业的样品管理公司可提供整套的样品管理产品包括 自动化的储存系统 大型系统可储存60000000样品 储存环境温度可达到-80 自动化样品处理设备 样品称量溶解微孔板间复制封膜Cherry picking 软件 储存系统控制软件样品管理系统软件 耗材 微孔板微试管封膜Barcode Sample management technology 瑞士Tecan公司的样品自动化储存系统产品 Click to view the video REMP Large-size storeTM LSS 要素三自动化 自动化技术的应用提高筛选效率摆脱人为误差因

24、素 微孔板Microplate 微孔板Microplate是许多方法和解决方案的最终决定因素尽管近年来的芯片技术发展很快但微孔板在生物医药研究中仍扮演着不可替代的角色正是微孔板的应用使人们提出了将多个反应管以平行方式同时处理的概念这些概念一定程度上大大促进了自动化筛选系统和工作站的快速发展 对于所有开发的仪器而言微孔板是一个共同的标准同时标准化的要求也增加了现代自动化系统的可靠性其中96孔板和384孔板都已经制定了相应的标准 Society of Biomolecular Screening task force "Standards" in Automation and

25、instrumentation 但是其他的高密度板如86415363456甚至9600孔板目前还没有统一的标准这些标准或准标准板的使用已经大大地降低了筛选成本同时增加了通量 Microplates 微孔板是筛选的载体其制造技术也随着筛选技术的发展而发展包括 微孔板的颜色和材料 微孔板微孔的设计和密度 微孔板材料的表面处理 Fluorogenic Quenched Substrate FRET Example of use of FRET in a protease assay Matayoshi et al Science 247 954 1990 时间分辨荧光共振能传递Time Resolv

26、ed FRET LANCE Assay for Kinase LANCE Assay for Transferase and Nuclear receptor LANCE Assay for Protease and Helicase AlphaScreen AlphaScreen for PIP3 AlphaScreen for cAMP BRET 闪烁亲近检测法 Scintillation Proximity Assay SPA FlashPlate - SPA without Beads Bind Receptor Or Target to Plate Radiolabeled Trac

27、er and Sample added Only bound Tracer is Measured 常用的蛋白水解酶检测方法 常用的蛋白水解酶检测方法 常用的激酶检测方法 常用的磷酸酯酶检测方法 以酶为靶点 以酶为靶点进行的高通量筛选的优化及标准化涉及以下几个步骤 确定反应条件如缓冲液pH温度 天然或合成的底物的确定 酶动力学 信号窗口的评价 对已知抑制剂的反应情况 底物转变为产物后分别使用显色反应荧光或放射性化学的方法等适用的靶点不仅包括蛋白酶激酶和磷酸酯酶也包括其它酶类如DNA连接酶和解旋酶 细胞水平检测 荧光成像检测 FLIPR 贴壁细胞或悬浮细胞中Fluo-3的荧光强度间接反映钙离子的

28、浓度在FLIPR实验中可以用96孔或384孔板对多个样品同时检测测定荧光强度的过程仅需1秒可进行钙离子内流的动力学检测 FLIPR functional screening assay L GTP GDP PLC inositol phosphates Ca2 Fluorescent dye fluorescent signal 报告基因 报告基因受一个可诱导转录因子的调控从而响应受体的活动并指导报告蛋白的合成 对应不同的细胞株可有多种报告基因和载体可供选择常用的有萤火虫荧光素酶 luciferase 分泌型碱性磷酸酯酶 secreted alakaline phosphatase SEAP

29、氯霉素乙酰转移酶 chloramiphenicol acetyltransferase CAT -半乳糖苷酶 -galactosidase -内酰胺酶和绿色荧光蛋白 GFP Reporter Gene Bait Protein Binding Domain Prey Protein Activation Domain Two hybrid proteins are generated with transcription factor domains Both fusions are expressed in a yeast cell that carries a reporter gene

30、whose expression is under the control of binding sites for the DNA-binding domain The Two-Hybrid System Reporter Gene Bait Protein Binding Domain Prey Protein Activation Domain The Two-Hybrid System Interaction of bait and prey proteins localizes the activation domain to the reporter gene thus activ

31、ating transcription Since the reporter gene typically codes for a survival factor yeast colonies will grow only when an interaction occurs Quantum dots Invitrogen 公司的Qdot技术 Quantum dots 是一种与蛋白质尺寸相当的半导体材料具有独特的荧光特性已成为筛选药物的有利工具 荧光持续时间时间长适合时间分辨检测 颜色多样在同一激发波下不同尺寸的微利可发出多种激发光加上其表面可以耦联多种生物分子可同时标记多个靶点 安全细胞毒性

32、低可用于活细胞或者体内研究 Qdot的结构 High Content Screening High Content Screening Cellomics ArrayScan KineticScan Molecular Devices Discovery-1 Visualize and analyze cell populations Identify sub-cellular protein localization Perform multi-parameter analysis Live cell assays to detect translocation of signaling p

33、roteins primary screening lead profiling Pathway screening for functional effect rather than specific mode of action eg in vitro binding catalytic activity Modulation of protein translocation is an alternative to inhibition of catalytic activity protein translocation modulators Translocation Assay P

34、rotein Translocation is Essential for Intracellular Signaling The PKBAkt Pathway Greater Selectivity with Translocation Modulators Active Site inhibitors often lack specificity and selectivity unwanted side effects Many signalling proteins with very different functions share similar active sites - e

35、g Protein Kinase C family ATP and Substrate binding sites cPKC nPKC aPKC Other binding sites X X X X X X PKC catalytic inhibitors all act on ATP-binding site Other binding sites could be targets for specific selective inhibitors GFP Fusion Proteins for Detecting Translocations molecule of interest G

36、FP promoter Make stable transfected cell lines Quantify intracellular translocations of target in high throughput Membrane to Cytoplasm Translocation Example Pathway Therapeutic area PLCd Phosphoinositide Many MARCKS PKC Cancer Diabetes Membrane Receptors Receptor internalization Many Target PLC-PH

37、domain Host cell type CHO-hIR Stimulation ATP Timescale 5-20 sec Cytoplasm to Nucleus Translocation Example Pathway Therapeutic area p65 NFkB TNF etc Inflammation ERK1 MAPK Cancer p38 Stress Inflammation JNK cJun Cancer b-catenin Wnt Cancer Nuclear receptors RXR LXR estrogen etc Many TFs Transcripti

38、on Many Target Erk1 Host cell type HeLa Stimulation FCS hEGF Timescale 10 min 高通量药物筛选与创新药物研究 中国科学院上海药物研究所 国家新药筛选中心 李佳 内容 高通量药物筛选 模型建立化合物制备自动化数据处理 我国高通量药物筛选的现状 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的策略 组合筛选模型体系分子家族筛选模型体系化学生物学方法研究活性化合物作用机制 我们在高通量药物筛选与创新药物研究方面的研究实例 化合物资源 药物发现 DRUG DISCOVERY 药物开发 DRUG DEVELOPMENT 1 临床前研究

39、2 临床研究 药物候选化合物 药 新 1药物先导化合物的发现 2药物先导化合物的结构优化 新药研究的两个阶段 分子生物学 细胞生物学 基因组学 蛋白组学 生物信息学 结构生物学 计算机辅助药物设计 药物化学 高通量筛选 技术 天然产物 化学合成 组合化学 化合物库 筛选模型 结构优化 先导化合物 筛选 药物发现的关键环节高新技术集中的焦点 高通量筛选HTS 运用自动化的筛选系统在短时间内在特定的筛选模型上完成数以千计甚至万计化合物样品的活性测试一般而言日筛选能力应在10000次以上方可以称为高通量筛选 The Evolution of HTS 高通量筛选 快速-每天筛选上万药次 微量-筛选样品

40、需要量为微克级 灵敏-准确判断筛选样品的活性和选择性 经济-筛选费用低 常规筛选 高通量筛选 常规筛选和高通量筛选 高通量筛选的四个要素 样品制备 自动化 HTS 模型建立 数据处理 要素一高通量筛选模型建立 针对某一特定靶点设计一种生物活性检测方法并使之适用于高通量筛选 选择高通量筛选的靶点 来源于基础科学对于一种疾病进行细致研究后的理解和发现根据这些结果我们可以选择其中关键的生物效应环节进行干预这些靶点包括受体酶激素因子离子通道和蛋白间的相互作用等 Current Drug Targets Membrane Receptors45 Enzymes28 Hormones and Factors11 Ion